《ELISAwesternblot免疫组化RT-PCR实验方法原理及其在SCI论文材料方法结果中的写作》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ELISAwesternblot免疫组化RT-PCR实验方法原理及其在SCI论文材料方法结果中的写作（91页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、免疫学实验技术及荧光定量PCR内容提要 抗原和抗体 ELISA Western blot 免疫组组化（免疫荧荧光） Real Time PCR抗原和抗体u 抗原的基本知识u 抗体的基本知识u 多克隆抗体u 单克隆抗体抗原和抗体抗原的基本知识识l 定义：抗原（antigen）是能够刺激机体产生免疫应答的效应物质（抗体 和致敏淋巴细胞），并能与之特异性结合的物质。l 两个基本特性：免疫原性（immunogenicity）：能够刺激机体产生抗体和效应T淋巴细胞 的免疫反应能力。抗原性（antigenicity）：与免疫反应最终产 物（如抗体和/或T细胞表面受 体）特异结合的能力。l 完全抗原与半抗原
2、l 抗原表位（Epitopes）：抗原决定簇。 存在于抗原分子中，决定抗原特异性的基本结构 或化学基团。是与TCR/BCR及抗体结合的基本单位。抗原和抗体抗体的基本知识识l 定义：antibody。指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆 细胞增殖分化成的浆细 胞所产生的、可与抗原发生特异性结合的免疫球 蛋白。l 结构与功能：1）重链轻链 ；2）超变区是抗原结合位，与抗原表位互补；3）抗体Fc片段上两结构域共同与细胞膜 Fc受体结合，发挥 不同的生物学效应。l 应用医学应用：1.诊断：各类血清学检测 ，抗人球蛋白测试 ，早孕检测 等。2.治疗：单克隆抗体疗法（类风 湿性关节炎多发性硬化
3、症等），肿瘤治疗。科研应用：免疫共沉淀、免疫印迹、染色质免疫共沉淀、免疫荧光技术、ELISA等。抗原和抗体多克隆抗体抗原多个表位诱导 多种B细胞克隆增殖与分化，产生多种抗体的混合物。特点：多抗是单抗的混合物，群体综合的性质。更容易捕捉抗原。特异性相对较差：交叉反应抗体的纯化、标记难。抗原和抗体多克隆抗体制备备 动物选择 ：兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）
4、。马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。豚鼠（guinea pig）：国外实验 室常用。抗原和抗体多克隆抗体制备备延长抗原的作用时间 增强吞噬作用 刺激抗原提呈促进细胞因子分泌 诱导淋巴细胞分裂、增殖 影响T细胞“极化”佐剂的作用机理：抗原制备： 商品化或自行表达基础免疫：首次， 抗原用量大，用弗 式完全佐剂（含矿 物油,卡介苗等)。加强免疫：第2次以后， 抗原量减半，多次，间 隔2-4周，用弗式不完全 佐剂(不含卡介苗).取血测效价：加强免疫两次 或三次以后的第7 天取血。放血制备血清： 可一次放血(颈动脉) 也可多次取血(耳静脉)过程（简单了解）：抗原和抗体单单克隆抗体单个
5、抗原表位诱导单种B细胞克隆增生与分化，产生单克隆抗体。什么情况下需要制备单克隆抗体？目的蛋白有结构类似物抗原不纯，无法分开多抗效果不好（已排除非特异性反应）希望将抗体用于治疗，研制成药品希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂ELISAu 基本原理u 方法种类u 实验操作u 应用u 常见问题分析u 写作实例ELISA基本原理 全称：酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay） 原理：（1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物” ；辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）（3）酶反应的底物。ELISA方法种类类直接法
6、检测Ag将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可 测定抗原总量。 优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。 缺点：实验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做 标记，费用相对提高。ELISA方法种类类间接法检测Ab用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标二抗，加底物显色 。优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定 分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。 缺点：交互反应发生的机率较高。ELISA方法种类类双抗体夹心法检测Ag将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶 标二抗结合，形成抗体-待测抗原-酶标二抗的复合物，复合物 的形成
7、量与待测抗原成正比。适用于某些大分子的具有至少双 表位的抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。 优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。 缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。ELISA方法种类类其他方法双抗原夹心法、竞争法、捕获法、基于细胞法酶底物颜色HRP3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)+H2O2黄色(450nm)邻苯二胺(OPD)+H2O2橙红(429nm)5-氨基水杨酸(5-ASA)+H2O2棕色(550nm)鲁咪诺+H2O2荧光AP对硝基苯磷酸酯(P-NPP)黄色(405nm)4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)荧光-半乳糖苷酶4-甲基伞基-半乳糖苷荧光ELISA实验实验 操
8、作包被：聚苯乙烯板封闭： 0.12%BSA，5%脱脂奶粉，1%明胶，10%小牛血清孵育：加抗原/抗体洗涤：PBST、TBST、PBS等显色：避光发色结果测定：吸光值待测孔（P）与阴性对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者为阳性。ELISA应应用ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测 一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。 检查抗原和半抗原方面：在内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜促 性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等；在血液学方 面可用于检查凝固因子（如第凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（ Hapto Glo
9、bin）等；在肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（ CEA）。检查抗体方面：用ELISA间接法检查抗体，已获得对多种传染病和寄生虫 病的血清学诊断，亦开始广泛用于现场流行病学调查。在寄生虫病方面， 它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、囊虫、弓浆虫、 肺吸虫、肝吸虫、血丝虫、旋毛虫病等血清学诊断；在免疫性疾病方面有 试用作自身疫病抗体测定以及对过敏的诊断，例如检测各种过敏原的抗体 、DNA抗体及甲状腺球蛋白抗体，红斑性痕疮抗体等等；在卫生学方面 ，可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等。 ELISA常见问题分析 阴性对照出现阳性结果试剂或样品可能被污染，或者由于
10、孔之间的溅洒出现交叉污染。 酶标板洗板不彻底。 抗体量过多导致非特异结合。 夹心法、捕获法中检测抗体与包被抗体/抗原交互反应。 酶标板整体背景高抗体非特异性结合。 底物结合浓度过高或反应时间过长。 底物溶液不新鲜或被污染。 底物孵育过程没有避光。 吸光度数值偏高或偏低样品中待检抗原含量太低会导致测试结果偏低。 加入抗体量不合适也会造成结果偏低或偏高 孵育时间不够长会导致检测结果偏低 孵育温度不适合。ELISA写作实例详细描述IF = 3.534ELISA写作实例抗体浓度抗原种类AbsIF = 3.534ELISA写作实例引用文献ELISA写作实例 浓度时间ELISA写作实例操作手册ELISA写
11、作实例浓度组别Western blotu 定义及原理u 应用u 实验操作u 常见问题分析u 半定量分析u 写作实例定义义及原理 定义：又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而 后 利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。 原理：Western blot应应用Western blotWestern Blot 被广泛地应用于蛋白质研究，基础医学和临床 医学的研究。 目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的半定量分析实验实验 操作Western blot转膜免疫反应显色或发光蛋白定量SDS-PAGE蛋白提取封闭实验实验 操作Western blot步骤
12、一、蛋白提取 WB过程中最重要的一点就是确定目的蛋白在组织 、细胞中的定位，选择 合适的提取方法把目的蛋白提取出来才能进行后续的实验 。 防止蛋白质质的降解 冰上操作 加入蛋白酶抑制剂 Bac-细菌蛋白抽提试剂 Mam-哺乳动物蛋白抽提试剂 Yea-酵母蛋白抽提试剂 Tis-组织 蛋白抽提试剂 Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂实验实验 操作Western blot步骤二、蛋白定量实验实验 操作Western blot步骤三、SDS-PAGEESDS 是一种离子性的表面活性剂,它有强离子性的硫 酸根离子也带有疏水性的长碳链。当 SDS 与蛋白质混合时，它会以其碳链与蛋白质 的疏水性氨基酸结合将蛋白质
13、包起来,而以磺酸根离 子外露与水分子作用。大多数蛋白质和 SDS 的平均 结合量是 1:1.4 (以重量为单位)，而蛋白质结合固 定比例的SDS 后 ，由于 SDS 带强负电荷，使蛋白 质原先所带电荷显得微不足道,且每单位重量的蛋 白质所带电荷一致 ，所以不同蛋白质的迁移率大小 就主要由蛋白分子大小这一主要因素决定。实验实验 操作Western blot步骤三、SDS-PAGE凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（ ）线性分离范围 （KD)1512-431016-687.536-945.057-212Staking gelSeparating gel实验实验 操作Western blot步骤四、转膜
14、 膜的选择选择 ：NC、PVDF、尼龙膜 转转膜方法：半干转、湿转 转转膜确认认：立春红染色、蛋白预染Marker实验实验 操作Western blot步骤四、转膜实验实验 操作Western blot步骤四、转膜p 半干转 用滤纸吸Buffer来做转移体系的转移方法； 适合转移小分子量的蛋白； 半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据 蛋白分子大小定的； 56mA/膜 1h p 湿转 将膜、胶、滤纸整个浸泡在Buffer的Tank里转移的方法； 适合转移大分子量（100KD以上）蛋白； 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定； 300mA 1h实验实验 操作Western blot步骤
15、四、转膜u丽丽春红红 可逆染色，检测转 膜效率。 与下游WB检测 完全兼容，无任何干扰。u蛋白预预染Marker 实时监测 分子量参照 与目的蛋白同时转 移至印迹膜上，检测转膜效率。u对转对转 膜后的凝胶进进行考染转膜确认实验实验 操作Western blot步骤五、封闭为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，去除非特异结合位点。常用的封闭闭液：Blocking Buffer ：3% BSA 5% MilkRoom Temperature 1 h 实验实验 操作Western blot步骤六、抗体孵育 一抗选择选择 ： 单单克隆抗体 或者 多克隆抗体 直接标记
16、标记 的抗体 或者 未标记标记 的抗体 抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的，为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数.实验实验 操作Western blot步骤六、抗体孵育二抗的选择选择 ：抗小鼠抗兔抗大鼠抗人抗山羊抗鸡抗豚鼠抗马标记物HRP、AP、Biotin、荧光标记、无标记荧光标记抗体红色Cy3、TRITC、RRX、Texas Red X、Dylight549、Dylight 594、Dylight 649绿色FITC、Cy2、Dylight488蓝色AMCA近红外线Cy5根据一抗物种：根据标记物：实验实验 操作Western blot步骤七、检测方法化学发发光法：常用HRP酶标标系统统的显色底物为ECL鲁米诺（Luminol）特点：无毒害、灵敏度高、
