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1、广西大学硕士学位论文水牛腔前卵泡分离培养的初步研究姓名：冯贵雪申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：石德顺2003.5.1! 查黧查：查竺些熬照竺竺苎苎篓黧翌苎竺墨水牛腔蓠爹器泡分离培养的初步研究 摘要本聚究瓣零譬势泡在翔巢审的分布规律及缝织学特锰、永牛腔蓠麴泡的分离与培养方法进行了系统研究。( 1 ) 用常规石蜡切片法研究水牛卵泡在卵巢中的分布规律与结构特缝。 结果表弱，各级翱沲的分雍舆蠢明显的区域性：原始麴泡位予翱巢皮质的最外瑶，形成原始卵沲层，初级卵泡位于皮质的中层，次级爹算泡位于富含m 管的皮质最内层；原始卵泡、初级卵泡和次缎卵泡的赢径分别为3 6 9 士7 7 ，4 8
2、 。7 8 。9 和9 1 9 士2 7 。3 p L m ；警之对应卵母细胞的童径分潮为1 9 6 走6 0 ，2 7 3 + - - 7 1 ，4 9 1 盘1 7 。4 陲m ；原始卵泡和襁级卵淹酌鬏粒细胞数为1 0 8 - I - 2 3 个和1 8 1 + - 3 1 个。、#t 2 0 转m 灏天膝薅辩漶，体乡 域功臻葬2 8 d ，并熊产生蒺澈索( E O 。麓 虚等( 2 0 0 2 ) 培养了周谶法分离的牛腔前卵泡，蠢5 0 形成了鲫泡腔。许多的研究都表鹈，该法努囊爨遣熬逮嶷骧馒，不耱满足夫量分离蕊霪要，搬不适合嚣枝， 、予l 瀚转瓣魏整藏辩海，懿麓爨凝雾遵弱鹱鬃。2 1 4
3、 酶鳃念橇藏法长黧来滋褒家整靛瓣露逡熬努离楚遽点，褥辩滤努禽骞寞蕊突渡戆怒F i g u e i f e d o 等( 1 9 9 3 ) 建立了一囊辩络合撬壤滚，成魂翦鹜牧犬鬣字羲馨缀辩稳。H i r a o 簿 1 2 0 肛m 的卵泡，体外成功培养2 8 d ，能产生雌激素( E 2 ) 。研究中述发现， F S H 对久菠兹辩遗煞发鸯秘努浚蕴静形藏是登褥戆，L H 麓壤强这耪穆耀。S a u n d e r s 等( 2 0 0 0 ) 研究发现，人腔前卵泡颗粒细胞上存在雌激素B E 2 的受体。Q u 等( 2 0 0 0 ) 研 究结暴表明扶簸始郛泡至g 有整雾泡中鹭存豫F 。a
4、、彝脯F 受髂熬表达。W u 等( 2 0 0 0 )对人胎儿腔前卵泡表明，其体外发育和成熟与体内的发育存在差异。卵泡熊发育到1 2 0 f x m 以上，f 强没有形成整；延长培养詹发旁到成熟并接出第一投髂。在舅母缨胞成熟过程中，I G F I 的作用优于E G F 。7 展望目前哺乳动物腔前辩泡豹硪究中，只有小鼠产下后代( E p p i ge ta l ，1 9 8 9 ，1 9 9 6 ；L u ie ta l ，2 0 0 1 ) ；猪脏漪卵泡体外发育成熟履实现精予穿入( H i r a oe ta l ，1 9 9 4 ) 并发育到囊胚 ( W ue ta l ，2 0 0 1 )
5、 ；绵羊( C e c c o n ie ta l ，1 9 9 9 ) 、山羊( H u a n m i n e ta l ，2 0 0 0 ) 、奶牛( G u t i e r r e ze ta l ，2 0 0 0 ) 和牛( M c C a f f e r y e ta l ，2 0 0 0 ) 的腔前卵泡在体外培养己熊形成卵沲腔。僵蘸前尚不能完全模拟卵泡在体内的发育环境条件和机制，腔前卵泡的分离培养尚荫大量工作要徽。1 7硪量能文：水牛腱精峁泡分离培崩。的却步研兜第二部分水牛腔前卵泡分离培养的初步研究 ( 实验研究)实验砰究第一章水牛艟黄郭泡的分布及形态学磷究摘要：随机从屠宰场取水
6、牛卵巢1 1 个，遇过常规石蜡切片观察卵泡在卵巢中的分布规律，并测量卵泡、卵母细胞直衽大小，计算颗粒细胞的数量。结果发现，各级卵泡的分布舆毒暖显的嚣域- 跹：愿始势泡彝初级秘泡分嬲位于血管帮少的费巢皮质最铮层争中层，次级卵泡证于富含血管的皮展最内层；原始卵泡、初级帮泡和次级卵泡的直径分嬲为3 6 97 7 、4 8 7 9 0 和9 1 9 2 7 3 ，对应卵母细胞的直径分别为1 9 6 6 0 、2 7 3 7 1 和4 9 11 7 4 1 x m ；原始卵泡和初级卵泡的颗粒细胞数分别为1 0 8 2 3 个和1 8 1 3 1 个，次级努泡含毒2 6 层颗粒鳃藏，在2 - , 4 层对
7、葵分毒零碡，一穗较多，而另一镯较穸。关键谢；水牛；腔前卵泡；形态擎哺乳动物卵巢含有数万个卵泡，其中绝大部分为腔前卵泡。然而，能发育到成熟劳瓣雾豹露逡必数甚多，缝9 9 。9 夔劈懑在装蔫努浚除段翅铰、遐纯，这无聚麓动物遗传和育种资源的极大损失( B r i t te ta l ，1 9 9 1 ；S a u m a m d ee ta l ，1 9 9 1 ) 。目前卵母桶胞是体外受精、动物克隆和转熬因等胚胎生物技术研究必不可少的实验材料，卵母细胞来源匮乏成为了制约这些技- 术研究进展的主要因素，卵懿腔前秘泡的“歼发利用无疑是髌凌这一难遂鹣霄效途径。近年来，哺乳动物腔前卵泡的分离培养成为生命科
8、学研究的热点之一。但只有清楚了解卵泡谯卵巢内的分布状况及体内卵泡的发育规律，才能高效地将卵泡分离出来著蔹摆其援德成凌豹迸薯予俘羚培莠，j 毽：强歪拳生理状浇下戆琏翦舞浚组织学特疑还可作为体外培养过程中卵泡发育状况的舔定标准。为此，许多研究港对牛( 高立云等，2 0 0 2 ) 、羊( L u c c ie ta l ，2 0 0 1 ) 、牦牛( 蒙学莲，2 0 0 2 ) 等动物卵巢及卵泡系统进行组织学研究，假目前关于水牛这方恧的研究报道甚少。因此，本研究跨在再清水牛卵巢筵藩饔连静分帑及其缰织学特惩，黄瀵一步露努分嘉培莽奠定坚安静基醛。1 材料和方法1 1 舞巢来源及处理来自本堍的屠宰场的中
9、国沼泽型水牛卵巢。蘑宰承牛之后，手术摘除辩巢，将萁簧于含有3 5 3 9 。C 生理赫水溶液的保温瓶内，在4h 之内送回实验室。1 1 2 卵巢组织切片豹制作睫梳取1 1 个壹径终1 1 5 c m 成年窳牛辩巢缀织麓B o u i n 氏阐定滚固定1 2 h ，然后按照常规切片制作方法进行水洗、脱水、透明、稷腊、石蜡包蠼、切片、H E 染色、封片。1 9磺奄论文：水牛麟糟捧 鼙分龠垮蒸触船步研究l ，3 拜巍溪裘每个鳃懿蕤魏取不麓甥嚣魏片缀绫切片，懑倒鬟显徽镜下双察黪泡在卵巢中的分布情况；在每片切片中随机选3 个视野用测微仪测擞各级卵泡及对应卵母蜘胞的大枣、颗黢缁瞧数稆透明豢穗璁豹蠖况。浏量
10、对激纂疯袋豹最大鼹离 9 0 p r o 舞漶的 餐逮畚警的低得多 9 0 t t m 的卵泡眈饲眈永牛的低褥多( 2 8 1 、1 6 V S4 1 1 、1 6 8 ) ，表明M 1 法回收的小卵泡较多。4 结论( 1 ) M 1 不仅能成功分离隶牛腔魏露泡，毽熊嵩效静分离黄牛努灌，并且不损霞郛泡的基膜，其适合的针距为5 0 0 7 5 0 “m 。( 2 ) M 1 法霞牧窳牛鞫黄牛黢翦露淹瓣藤络辩泡毙镶竣离，耪缀露滤次之，次级舞泡的比例最低。! 妻鎏查：查兰璧楚登苎竺查竺篓整翌兰至墨一一一实验研究第三耄水牛腔懿卵泡体外塔养豹研究摘要：本研窥探讨了水牛腔前卵泡大小、培养方法及相荚因子对其
11、发育的影响，初步建立了一套水牛腔前卵泡的体外培养体系。 试验一按照2 x 2 2 霹平试验设甘分为8 纽，主要研究维生素C ( 0 ，S O # 咖1 ) ，F s HO ，t 0 0 n g m 1 ) 套E G F 0 ，5 0 n g m l 对拳牛腔羲印泡发毒磅影喃。结果发琨，F S H 匏促进卵泡的体外增长( p O 0 5 ) ，但对卵地形态及存活没有影响( P 0 0 5 ) ；维生素c 能维持培养胼期卵泡的形态( p 0 0 5 ) ，对卵泡增长及存活没有影响( P 0 0 5 ) 。当同时添加F S H 与维生素C 酵，F S H 健增长争维生素C 维持卵泡彤态的非用都明照加
12、强，存活鼙也显著提离( P ，髭 攀黎藿定媳潢嚣羹努瀵筑裙疑褰凌缀转匏。“ r l 瓣m a s 等( 2 0 0 i ) 褥蕊变爱溪，V c 蔻维持牛黢谢黪泡在藩外潦葬过程中的德梅完整，谯小疑盘簿澍瓣群的维暴( W ue ta l ，2 0 0 1 ) 。进步研究发瑗，在卵泡黪靛窝过程中，激豢、生长阑子、备j 申物旗 蔓往不避擎一豹疑生终弱弱，露燕死静生长粥予之弱或与擞豢及荬它彩矮蠲蘧互璇节，登在努逮戆不麓笈育狳葭，袋襻不嚣懿霈籀，霹予苓褥凌穆，蓑搏勰衮瑗遴苓一。许多研究发现培养方法对卵泡的发育至关重桑，并且物种闯藏辫显著。梅串的腔麓郛逸磺炎中，已用了多耪培养方法翱= ：难法进行差异的撼著性
13、检验。2 结果2 1F S H 、V c 、E G F 对辩滚发育熬影穗如表1 所示：在整个培养期，F S H 、V c + F S H 、E G F + F S H 均盥著的促避卵泡的增长( P O 0 5 ) 。当F S H 与E G F 协同作用错，彼此促增长 乍用都显饕提高P 32 3 ( 4 美6 )兰维3 58 3 7 - + 6 38 ，9 46 b2 ( 5 、7 ) b2 ( 5 7 ) b1 0 9 6 ，2 b4i 1 1 4 ) b1 9 ( 5 7 6 ) H H _ _ _ _ - _ _ _ m - _ _ _ _ h _ H _ _ _ w _ _ _ _ _
14、_ - _ w H _ _ - - - _ _ _ _ - _ _ _ _ m - _ 一_ H - _ - _ - H H u _ _ _ - 一 注：娆裘示列痰是祷不强上振戆壤差异显蔫( P 9 0 t m 的卵泡效果稳定、增长速度较快，9 0 1 2 0 ，1 2 0 1 5 0 ，1 5 0 1 8 0 p m 的卵泡异常率和存活率分别为4 6 2 、3 6 O 、3 9 5 和6 2 2 、7 2 0 、7 6 3 ，l O d 肉卵泡平均蹭长1 6 7 ，2 0 6 ，2 6 5 v t m 。这表明随着弱泡壹径静瑶大，萁体外发商能力也增强。 9 0 v m 卵泡体外发育能力明显增
15、强，效果相对稳定。推测可怒是卵滤发育弱粥H m 这一特定辩赣，持续产生菜些维持癸海生长发鸯豹因子。毽G u p t a 等( 2 0 0 2 ) 研究表明，水牛小腔前卵泡( 3 7 9 0 a m ) 比大卵泡( 9 1 1 t i m ) 生长快。这萃孛结莱豹差异霹缝是由予培莠滚藏份、壤莠方法、培莽祭 孛不霹获致。据报道，盥径为4 0 9 0 m 的小牛胶前卵泡体外培养7 d ，直径增加2 0 m ，大腔翁努泡培莽5 d 袋蜀班燃热5 5 t m ，这提示大耍瀵豹发鸯缆力毖小爨泡豹强( k a t s k a e ta l ，1 9 9 8 ) 。本研究发现，大腔前卵泡体外增长速度比小前卵泡
16、的快得多，表明水牛数腔藤隳泡体终发育能力毙牛郛泡豹发商能力熬，这与P a l t a 等( 1 9 9 8 ) 的结论一致。G u t i e r r e z ( 2 0 0 0 ) 和M c C a f f e r y ( 2 0 0 0 ) 用M c C o y 、s 5 a 培养牛大腔前卵泡( 1 6 6 耻m 左右) 熊体外发寅2 8 d 并形成了卵泡腔。周虚等( 2 0 0 1 ) 用无般清的培养液培养牛的腔前卵泡1 0 d ，有5 0 的卵泡在培养过程的开始阶段盏径增长，约有5 0 的卵泡形成了卵泡腔。本研究培养1 0 d 没有发现卵泡腔的形成，表明水牛腔前卵泡的培养非常困难。3 3 珐莽方
