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1、广西医科大学硕士学位论文VEGF SiRNA抑制人舌癌细胞VEGF蛋白表达的研究姓名：姚志文申请学位级别：硕士专业：口腔颌面外科学指导教师：于大海20060501V E O F $ i R N A 抑制人舌癌细胞v 】搿蛋白表达的研究2 0 0 3 级硕士学位论文v E G FS i R N A 抑制人舌癌细胞v E G F 蛋白表达的研究中文摘要目的( 1 ) 构建V E G F S i R N A 表达载体。( 2 ) 检测R N A i 在转染人舌癌细胞( T C A 8 1 1 3 ) 后特异性抑制V E G F 表达的作用。方法( 1 ) 合成2 对含有针对V E G F m R N
2、 A 序列的正反义寡核苷酸，退火后与P s i l e n c e r 2 1 U 6 一n e o 载体在室温下连接，该表达载体分别被命名为P s i l e n c e r 2 1 一U 6 一n e o S i R N A1 和P s i l e n c e r 2 1 - U 6 一n e o S i R N A 2 。( 2 ) 阳离子聚合体介导P s i l e n c e r 2 1 - U 6 一n e o S i R N A l 和P s i l e n c e r 2 1 _ U 6 一n e o S i R N A 2 载体及空载体转染人T C A 8 1 1 3 细胞，
3、经G 4 1 8 筛选( 浓度为4 0 0 m g L ) 8 d后，挑选细胞克隆扩大培养。同时设立正常情况下培养的T C A 8 1 1 3 细胞为空白对照组，用免疫组化法分别检测各组T C A 8 11 3 细胞内V E G F 蛋白的表达，并通过M I A S - - 2 0 0 0 医用彩色病理图像免疫组化测量系统对其表达进行分析，其结果用平均灰度表示。E L I S A 分别检测个各组T C A 8 1 1 3 细胞培养液内V E G F蛋白的表达。结果( 1 ) V E G F S i R N A 表达载体成功构建。( 2 ) 免疫组化结果经显微图像分析显示，空白对照组及空载体对照
4、组灰度值分别为：1 2 2 4 8 5 7 8 和1 2 4 3 3 5 6 7 。P s i l e n c e r 2 1 _ U 6 一n e o S i R N A l 转染组和P s i l e n c e r 2 。卜U 6 一n e o S i R N A 2 转染组灰度值分别为：1 5 4 1 2 6 5 4 和1 5 6 2 3 5 6 2 。空白对照组及空载体对照组比较，表达水平无明显变化( P 0 0 5 ) 。P s i l e n c e r 2 1 U 6 一n e o S i R N A l 转染组及P s i l e n c e r 2 1 _ U 6 一n e
5、 o S i R N A 2 转染组分别与空白对照组及空载体对照组比较，表达水平明显降低( P O 0 5 ) 。P s i l e n c e r 2 I - U 6 - n e o S i R N A I 转染V E O F $ i R N A 抑制人舌癌细胞v 】辩蛋白表达的研究2 0 0 3 级硕士学位论文组及P s i l e n c e r 2 1 _ U 6 一n e o S i R N A 2 转染组分别与空白对照组及空载体对照组比较，表达水平明显降低( P O 0 5 ) ，结果无统计学差异。P s i l e n c e r 2 I - U 6 - n e o S i R
6、N A I 转染组与空白对照组比较，P = O 0 1 4 ( P0 0 5 ) 。结果无统计学转染组与空白对照组比较，P = 0 0 1 72 1V I E G F $ i R N A 抑制人舌癌细胞V E G F 蛋白表达的研究2 0 0 3 级硕士学位论文( P 0 0 5 ) ；与空载体对照组比较P = O O l l ( P 0 0 5 ) ：P s i l e n c e r 2 I - U 6 - n e o S i R N A 2 转染组与空白对照组比较P = 0 0 1 3 ( P 0 0 5 ) ；与空载体对照组比较P = 0 0 1 0 ( P O 0 5 ) ；组间结果
7、有统计学差异。3 讨论新生血管过度生长是肿瘤快速生长和转移的重要基础。抑制新生血管生长是防治恶性肿瘤的一条重要途径。血管内皮生长因子( V E G F ) 在血管生成信号途径中起着关键的促进作用。V E G F 在舌癌细胞中高表达，抑制V E G F的表达，就可阻止肿瘤的血管生成，抑制肿瘤的生长。目前研究较多的有抗V E G F 及V E G F R 的单克隆抗体n ”，反义寡核苷酸基因干涉n 明，V E G F 片段等，但效果不甚理想。近几年来兴起的R N A 干扰技术，为肿瘤的分子生物治疗开辟了新的途径n 。与传统基因沉默技术相比，利用R N A i 进行基因功能研究具有许多独特的优点：(
8、 1 ) R N A i 具有很高的特异性，能够非常特异地只降解与之序列相应的单个内源基因的m R N A ；( 2 ) R N A i 抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度：而且相对很少量的双链R N A分子( 数量远少于内源m R N A 的数量) 就能完全抑制相应基因的表达，这表明很可能存在干涉效应信号分子的扩增机制：( 3 ) R N A i 抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持n 町。目前这一技术已在肿瘤的基因治疗方面显示出诱人的前景。目前为止较为常用的5 种制各S i R N A 的方法包括：化学合成、体外转录、长片断d s R
9、N A s 经R N a s e I I I 类降解( e g D i c e r ，E c o l i ，R N a s eI I I ) 、S i R N A表达载体或者病毒载体在细胞中表达S i R N A s 及P C R 制备的S i R N A 表达框在细胞中表达。每种方法都有自己的优点和缺点。哪种是最好的方法，其实取决于实验目的。在本研究中我们选用了S i R N A 表达载体制各S i R N A 的方法。主要考虑如下：多数的S i R N A 表达载体依赖3 种R N A 聚合酶I I I 启动子( p o l I I I ) 中的一种，操纵一段小的发夹S i R N A 在
10、哺乳动物细胞中的表达阻”1 。这3 类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U 6 启动子和人H l 启动子。选用P o lI I I启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转V E G FS i R N A 抑制人舌癌细胞V E G F 蛋白表达的研究2 0 0 3 级硕士学位论文录合成R N A ，遇到4 5 企连续的u 即终止，非常精确。当这种带有P o lI I I启动子和s h R N A 编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达S i R N A的质粒确实能够下调特定基因的表达，抑制范围包括外源基因和内源基因。采用这种方法的优点在于，通过S i R N A 表达
11、质粒的选择标记，S i R N A 载体能够更长时间地抑制目的基因表达删。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起化学合成来说，这就能够显著降低制备S i R N A 的成本。p S i l e n c e rS i R N A 表达载体系列是用于在培养的哺乳动物细胞中表达S i R N A 的一系列载体。在载体上包含有R N AP o lI I I 启动子，氨苄抗性基因和大肠杆菌复制子，只要将编码- d , 段对应目的基因特异序列的、其R N A 能形成发夹结构的D N A 序列插入载体中P o lI I I 启动子的下游，转入哺乳动物细胞，载体就能表达出发夹结构的R N A ，这种
12、R N A 很快在细胞中加工成为S i R N A 。这些表达载体已经成功地在H e l a 细胞中抑制了包括C y c l o p h i l i n 、G A P D H 、p 5 3 、c m y c 在内的多个基因的表达。实验表明：能够被化学合成或者体外合成的S i R N A s 抑制的基因同样可以被表达相同序列的载体生成的S i R N A s 抑制。在本研究中，我们设计了两对发夹状S i R N A ，将其分别命名为S i R N A1和S i R N A 2 。采用P s i l e n c e r 2 卜U 6 一n e o 载体，构建S i R N A 表达载体。经酶切证实
13、，2 对V E G FS i R N A 表达载体均构建成功，我们将其分别命名为P s i l e n c e r 2 卜U 6 一n e o S i R N A l 和P s i l e n c e r 2 I - U 6 一n e o S i R N A 2 。将该表达载体借助阳离子聚合体介导转染T C A 8 1 1 3 细胞，并经G 4 1 8 筛选后挑选细胞克隆扩大培养。为了证实我们设计的S i R N A 可抑制V E G F 表达。我们借助免疫组化检测P s i l e n c e r 2 卜U 6 一n e o S i R N A l 转染组T C A 8 1 1 3 细胞、P
14、 s i l e n c e r 2 卜U 6 一n e o S i R N A 2 转染组T C A S l l 3 细胞以及借助E L I S A 检测细胞培养液后发现，V E G F 的表达在P s i l e n c e r 2 1 - U 6 一n e o S i R N A l 转染组T C A S I1 3 细胞和P s i l e n c e r 2 1 _ U 6 一n e o S i R N A 2 转染组被抑制，与空白对照组及空载体对照组相比，表达明显下降。本实验研究结果显示，我们设计的针对V E G F 的S i R N AV E G FS i R N A 抑制人舌癌细
15、胞V E G F 蛋白表达的研究2 0 0 3 级硕士学位论文1 和S i R N A2 可明显抑制V E G F 的蛋白表达。这与国外文献报道的V E G FS i R N A实验结果相似：T a k e i 等化学合成V E G FS i R N A 抑制人前列腺癌细胞的V E G F表达，结果培养液上清V E G F 浓度明显下降汹1 。与之相比本实验采用D N A 载体细胞内表达s i R N A ，该方法对靶基因的抑制率与化学合成的s i R N A 相似，且可在细胞内较长期稳定表达s i R N A ，并可降低甚至杜绝核酸酶的污染。尽管目前R N A 干扰对这项功能强大的技术已经有
16、深入地了解，新的结果不断涌现，但R N A i 技术应用与肿瘤的基因治疗还需要进一步探索，相关问题有载体问题，S i R N A 序列的不同而产生不同抑制疗效，不同的m R N 对R N A i的敏感性不同及大于3 0b p 的d s R N A 可导致非特异性反应等。虽然如此，因R N A i 在基因特异性治疗方面的突出优势，使其在肿瘤基因治疗方面将具有更加广阔的应用前景。我们的研究证实了S i R N Al 和S i R N A2 可以有效阻断V E G F 蛋白水平的表达，这是本实验的第一阶段的一个方面，另一方面基因水平的检测即将开始。小结在本研究中我们发现：正常状态下，T C A 8 1 1 3 细胞浆内明显表达V E G F ，我们成功构建了V E G FS i R N A 表达载体，并将其通过阳离子聚合体介导转染T C A S I1 3 细胞后发现，V E G F 蛋白的表达明显降低。这提示了应用针对V
