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1、1中枢神经系统血管母细胞瘤细胞与人脑 神经元细胞差异蛋白质分析作者：刘杭 谢嵘 姚鋆 樊惠芝 朱剑虹 杨芃原【摘要】 以人工培养的中枢神经系统血管母细胞瘤(Central nervous system hemangioblastoma，HB)细胞为研究对象，发展了蛋白质组学分析方法，鉴定了 HB细胞与人脑神经元细胞的差异蛋白质。采用在线 HPLC 串联 LTQ Orbitrap 质谱鉴定样品的可溶性蛋白质，得到了 HB 细胞的蛋白质组表达谱。HB 细胞鉴定得到 674 个蛋白质，神经元细胞鉴定获得 531 个蛋白质。根据基于肽段鉴定的蛋白质组半定量分析方法对质谱数据进行蛋白质的差异比较分析，发
2、现了波形蛋白(Vimentin)，14 3 3 epsilon 蛋白和碳酸酐酶(Carbonic anhydrase ，CA )等在 HB 细胞中表达量发生明显变化的蛋白质，并对其进行了免疫组织化学染色分析。结果显示,波形蛋白(Vimentin)、14 3 3 epsilon 蛋白以及碳酸酐酶(CA )等蛋白质表达量的改变与 HB 的发病密切相关，对探索 HB 的起源有重要意义。 【关键词】 中枢神经系统血管母细胞瘤， 蛋白质组学， 高效液相色谱 质谱， 半定量分析1 引 言蛋白质表达量变化信息是蛋白质组研究的重要内容之一。与稳定同位素标记定量法1相比，无标记的蛋白质半定量方法是一种为了弥补单
3、纯依靠质谱信号强度定量的不足而提出的定量方法。本方法结合了传统色谱法的以色谱峰面积为基础的定量方法，以肽段鉴定为基础进行色谱峰的选取。其优点在于：具有较好的重现性和线性范围;无需额外操作(如同位素标记)，定量步骤全部由计算机完成;可以2灵活选择加入已知量的已知蛋白质或以样品本身含有的蛋白质为内标26。中枢神经系统血管母细胞瘤(Central nervous system hemangioblastoma，HB)是常见于小脑的良性肿瘤，其发病机理至今尚未阐明。世界卫生组织在 (http:/www.who.int/classifications/icd/)中将其归为来源未定肿瘤。以往对 HB 的研
4、究多集中在 VHL 基因上(Von Hippel Lindau 氏病，简称 VHL 病7)，并未从蛋白质组角度对其进行过研究。因此，采用蛋白质组学分析技术研究 HB，对探讨其致病机理有着重要意义。本研究采用在生物样本实验中广泛采用的 HB 肿瘤细胞，以二维液相色谱串联 LTQ Orbitrap 质谱技术鉴定 HB 细胞(简称 HB 组)和人脑神经元细胞(简称对照组)的可溶性蛋白质组，并利用半定量方法寻找 HB 组与对照组的差异蛋白质。建立了 HB 组的高质量精度蛋白质组表达谱，同时将高质量精度质谱应用于寻找HB 致病的相关蛋白质，探讨了 HB 的发病机理。2 实验部分2.1 仪器与试剂JY92
5、 2D 超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);UV mini 1240型紫外 可见分光光度计(日本岛津公司);Centrifuge 5417R 离心机(德国 Eppendorf公司); LTQ Orbitrap 质谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司), 用 2.0sr2 XCalibur软件包中的 LTQ Tune 控制，XCalibur 软件包中的 Qualbrowser 和 Bioworks 软件是本实验的数据处理软件。毛细管高效液相色谱系统(荷兰 LC Packings 公司)，由Famos 微量进样器、Switchos 微升级液相色谱泵(Switchos 泵)和 Ultima
6、te 纳升级3液相色谱泵(Ultimate 泵)组成，由 Chameleon 软件控制。分析过程中共使用 3 根色谱柱：第一维分析使用强阳离子交换 Bio SCX 柱(柱 1，内径 1 mm，柱长 150 mm，荷兰 LC Packing 公司);第二维反相分析前使用脱盐/肽段富集柱 Captrap 柱(柱 2，内径 0.5 mm，柱长 2 mm，美国 Michrom Bioresources 公司);第二维反相分析使用 Zorbax C18 柱(柱 3，内径 0.3 mm，柱长150 mm，德国 Agilent 公司)。尿素、碳酸氢铵、甲酸(分析纯，上海迪奥生物科技有限公司);Bradfor
7、d 定量试剂盒(美国 Bio Rad 公司);二硫苏糖醇、3 (3 胆固醇氨丙基)二甲基氨基 1 丙磺酸(CHAPS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂、乙腈和胰蛋白酶(德国 Sigma 公司);碘乙酰胺、醋酸铵(分析纯，上海化学试剂有限公司)。超纯水由 Milli Q 纯水系统(美国 Millipore 公司)制备。2.2 实验方法细胞培养所用的 HB 肿瘤组织样本均取自复旦大学附属华山医院神经外科2005 年 7 月2006 年 6 月收治的 HB 患者手术切除标本，共收集肿瘤组织 13 例，其中 VHL 病 6 例，非 VHL 病 7 例。HB 细胞和神经元细胞(各约
8、106 个)分别与 1 mL 细胞裂解液(8 mol/L 尿素、4% CHAPS、1 mmol/L PMSF、1 mg/L 亮抑酶肽、1 mg/L 胃蛋白酶抑制剂)混合，冰浴中孵育 30 min，15000 g15 min 离心(4 )，取上清液 1。沉淀加入细胞裂解液 100 L 进行超声破碎，15000 g15 min 离心(4 )，取上清液 2。合并上清液 1 和 2， 25000 g30 min 离心(4 )，取上清液，-80 保存。蛋白质浓度使用 Bradford 定量试剂盒测定。42.3 细胞样品酶解取 HB 组和对照组样品各 90 g，用 50 mmol/L NH4HCO3 溶液
9、稀释 1 倍，加入 5 L 10 mmol/L 二硫苏糖醇溶液，56 孵育 1 h。加 5 L 新鲜配制的 450 mmol/L 碘乙酰胺溶液，室温下避光静置 30 min，加入 2 L 1 g/L 胰蛋白酶，34 孵育 12 h 后，加 3 L 甲酸停止酶解。2.4 二维 HPLC 串联 LTQ Orbitrap 质谱分析鉴定HPLC 仪器全部由 Chromeleon 软件(Dionex 公司)控制。分析系统如图 1 所示。样品由 Switchos 泵以 60 L/min 的流速经阀 1 加载到柱 1。Switchos 泵同时也是将盐溶液加载到柱 1 上的上样泵。第一维分析用系列盐溶液(0，
10、50，100，200，400，800，1000，2000 和 2000 mmol/L NH4Ac)依次洗脱样品，洗脱的样品经阀 2 进入柱 2 脱去无机盐类。通过阀 2 的切换开始第二维分析; 第二维反相分析使用的流动相为 A 相：95%水、5%乙腈、0.1%甲酸;B 相：5%水、95%乙腈、0.1%甲酸。梯度为：090 min, 5%50% B; 9095 min, 含 95% B 的流动相再生柱 3; 95110 min, 含 5% B 的流动相平衡柱 3。由 Ultimate 泵以 2 L/min 的流速按照梯度在柱 3 上得到分离后实时送入 LTQ Orbitrap 质谱仪。设置LTQ
11、 Orbitrap 质谱仪扫描质量范围为 4002000 Da(分辨率 60000)，将扫描获得的谱图中最强的 5 个质谱峰进行串级质谱(MS/MS)分析。2.5 数据处理质谱数据通过内嵌于 Bioworks 软件的 Sequest 运算程序，使用美国国立生物5信息学中心(NCBI)人数据库(2006 年 12 月 RefSEQ 版本)进行搜索。参数设置为：母离子偏差容忍度 5010-6， 碎片离子偏差容忍度 1 Da。考虑半胱氨酸(Cys)甲氧基化(+57 Da)作为固定修饰，甲硫氨酸(Met)氧化(+16 Da)作为可变修饰。在设定蛋白质鉴定取信区间时要求肽段得分 Xcorr1.9(单电荷
12、)2.7(双电荷)3.5(多电荷)、Cn0.1、肽段质量精度不低于 1010-6，并且每个蛋白质至少要求有两条不同的肽段得到鉴定。经过验证，假阳性率为 1%。2.6 半定量分析在进样的蛋白质总量相同的条件下，以得到的每一个蛋白质的所有得到鉴定的肽段的色谱峰积分面积之和作为蛋白质自身的“峰强度”In，计算出每一个蛋白质在样品中的相对丰度(In%，即蛋白质的峰强度占样品所有峰强度和的百分比)，然后以细胞骨架蛋白 Beta 肌动蛋白为内标，将样品中 Beta 肌动蛋白百分比进行归一化校正，以其它蛋白质在两组样品的百分比的比值作为半定量的依据。具体方法为：(1)选取/提取合适量的两组样品;(2)选择内
13、标，该内标要求在两组样品中皆稳定存在，异构体少并且在样品中的含量不发生变化或变化极少。本实验选用 Beta 肌动蛋白作内标;(3)样品酶解后的肽段采用色谱 质谱联用仪鉴定;(4)计算每个得到鉴定的蛋白质的肽段的色谱峰面积， 利用内标对蛋白质的色谱峰面积进行归一化;(5)比较两组样品中得到鉴定的蛋白质的归一化后的色谱峰面积作为比较定量的结果;(6)选择 1.5 倍作为明显差异的阈值。2.7 免疫组化取 HB 组织和正常脑组织标本同时进行层厚 4 m 的常规石蜡切片，使用6SABC 试剂盒进行免疫组化染色，显微镜下观察，以细胞核和(或)细胞质出现棕黄色染色为阳性。阴性对照以磷酸盐缓冲溶代替一抗，阳
14、性对照参考各产品说明书。3 结果与讨论3.1 半定量分析本研究中，HB 组鉴定得到 674 种蛋白质，对照组鉴定得到 531 种蛋白质，两组中共有的蛋白质 314 种。经过半定量分析发现,了波形蛋白(Vimentin)、14 3 3 epsilon 蛋白、碳酸酐酶(CA )以及二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(NG,NG dimethylarginine dimethylaminohydrolase, DAAH)等表达量发生了明显变化，暗示了这些蛋白可能和病理密切相关。图 2 是以 HB 组和对照组在 200 mmol/L NH4Ac 下洗出组分为例的半定量流程示意图，用 Qualbrowser
15、软件的重叠模式同时打开两次实验文件并且以同一强度标尺显示于同一张图上，在前者为HB 组，在后者为对照组。两次实验中，两组均检测出了 Vimentin 的一条肽段(序列为 VERDNLAEDIMR)，在 HB 组中 Xcorr 分数为 3.20，质量精度为 1.910-6;在对照组中 Xcorr 分数为 3.66，质量精度为 0.610-3，均符合鉴定的统计性显著性标准。因此提取该肽段的色谱信号做提取离子流(XIC)，即图 2B。将鉴定到的Vimentin 肽段的 XIC 图的曲线积分面积之和对 Beta Actin 归一化后即作为Vimentin 的比较定量依据。图 2 半定量示意图(A)HB
16、 组(前)和对照组(后)的在 200 mmol/L NH4Ac 洗出组分的色谱总离子流(基峰)图; (B)Vimentin 肽段(序列 VEVERDNLAEDIMR)在 HB组(前)和对照组(后)提取离子流图将 HB 组与对照组的积分面积值相除即得到 HB组与对照组蛋白质的相对含量值。选取比率 HB/con1.5 倍和 con/HB-1.5 倍的蛋7白，共得到 64 个差异蛋白质。在这些蛋白质中，Vimentin 蛋白表达上调 4.5 倍，而 14 3 3 epsilon 蛋白以及 CA 则仅在对照组中检测到，与本研究组进行的HB 肿瘤组织的蛋白质组研究有所不同8。对前 3 种蛋白进行了免疫组化分析。免疫组化染色结果显示,Vimentin，14 3 3 epsilon 蛋白和 CA 在 HB 组织中的基质细胞及内皮细胞均呈阳性表达，而在正常人脑组织中呈阴性表达。 3.2 相关差异蛋白质3.2.1 Vimentin Vimentin 是间充质细胞的主要中间丝蛋白。中间
