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1、1下肢缺血预处理对大鼠心肌基因表达的 影响作者：张冬会 赵晓云 邢邯英 卢亚敏 庞国勋 司翠权【摘要】 目的 通过观察经下肢缺血预处理的心肌梗死大鼠心肌中缺氧诱导因子1（HIF 1）和血红素加氧酶 1（HO 1）mRNA 的表达，探讨其在缺血心肌中的作用。方法 将 SD 雄性大鼠随机分为心肌梗死组（40 只）和下肢缺血预处理组（40 只）；每组按缺血时间又分为 1、2、4、6、12 h 组。显微镜下计数外周血白细胞；HE 染色观察心肌组织中浸润白细胞的数值。应用逆转录多聚酶链反应（RT PCR）测定术后各时间点心肌组织中 HIF 1 和 HO 1mRNA 表达。结果 下肢缺血预处理后 12 h
2、 组外周血白细胞计数以及心肌组织中白细胞浸润数目较心梗组显著减少（P0.05）；心肌中 1、2、4 h HIF 1 mRNA 表达与心梗组对应时间点比较有显著差异（P0.01）。各时间点 HO 1mRNA 表达与心梗组对应时间点比较有显著差异（P0.01）。 结论 经下肢缺血预处理后，心肌损伤减轻，HIF 1 和 HO 1 可能与心肌保护作用有关。 【关键词】 下肢； 缺血预处理；心肌梗死目前，心肌缺血预处理(ischemic precondition ing，IPC)已从心脏扩展到心外组织，如下肢、肾脏、骨骼肌等，其短暂缺血不仅能减轻局部组织或器官的缺血损伤，而且对远隔组织和器官也有保护作用
3、，被证明是最有效的内源性心肌保护机制。Ockaili 等1的研究表明，缺氧诱导因子 1（HIF 1）诱导的血红素加氧酶1（HO 1）表达上调对缺血心肌有保护作用。但有关 HIF 1 和 HO 1mRNA 在2下肢缺血预处理中的作用机制尚未明了。本研究旨在阐述这两种基因在下肢缺血预处理对心肌梗死大鼠心肌的作用。1 材料与方法1.1 材料 主要试剂：逆转录酶（AMV RT ）、dNTP、Taq DNA 聚合酶、随机引物、琼脂糖均购自美国 Promega 公司。HIF 1、HO 1 及 actin 上下游引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。主要仪器：奥林帕斯显微镜（日本）；数字彩色显微图像分析
4、系统、PCR 扩增仪(PE5700)（美国）。1.2 动物分组与模型制作 选择雄性 SD 大鼠 80 只，体重 250300 g，由河北医科大学动物实验中心提供。所有大鼠实验前适应性饲养 1 w，室温（253），随机分为 2 组。(1) 急性心肌梗死（AMI）组：开胸并暴露大鼠心脏,结扎左冠状动脉前降支(LAD)。(2)下肢缺血预处理（LIP）组：分离双侧股动脉，动脉夹夹闭双侧股动脉 5 min，开放 5 min，反复 4 次，随后进行 LAD 结扎。各组均在操作结束后1、2、4、6、12 h 处死大鼠。每组每个时间点 8 只。心脏取血计数外周血白细胞，取心尖部分提取总 RNA，另取部分心肌组
5、织固定包埋行 HE 染色。1.3 HIF 1 和 HO 1 mRNA 表达水平的检测1.3.1 总 RNA 提取 Trizol 一步法提取组织总 RNA。紫外分光光度计测 RNA 的吸收度(A)值，A260/A2801.8 认为 RNA 较好无降解。采用 20 l 反应体系：总 RNA 2 g，随机引物 1 l，加去离子水补至 10 l，70水浴 5 min，迅速放冰上5 min。然后再加 M MLV 1 l，RNA 酶抑制剂 1 l，4dNTP 1 l，5M MLV 缓冲液 4 l，37水浴 4 h 合成 cDNA，所得 cDNA-20保存。31.3.2 目的基因 PCR 扩增 向优化体系中
6、加入以下成分：引物 1、2 各 5 pmol/L，cDNA 2 l，去离子水补足 20 l。在扩增仪上进行 RT PCR，PCR 的反应参数：HIF 1 955 min；94 30 s，53 30 s，68 1 min，循环 35 次；68延伸 5 min。HO 1 为 94 2 min；94 45 s，56 45 s，72 45 s，循环 35 次； 72延伸 5 min。 actin 为 94 5 min；94 35 s，56 35 s，72 35 s，循环 35 次；72延伸5 min。 4终止反应。1.3.3 RT PCR 产物半定量 取 RT PCR 产物 8 l 行 1.5%琼脂糖
7、凝胶电泳，80 V，45 min，目的基因扩增产物与 actin 扩增产物灰密度扫描之比作为目的基因的相对表达量。应用 UVP 凝胶成像分析系统分析实验结果。引物序列及扩增片段长度见表 1。表 1 RT PCR 反应引物序列及扩增片段长度（略）1.4 统计学处理 实验数据用 xs 表示,采用 SPSS13.0 统计软件处理，组间比较采用单因素方差分析,如有显著性差异,再进一步用组间两两比较 q 检验。2 结果2.1 组间外周血白细胞计数比较 LIP 组心梗后 12 h 外周血白细胞计数明显低于 AMI 组（P0.05），其余时间点组间比较无显著性差异。见表 2。2.2 两组心肌组织中白细胞浸润
8、情况 心梗后 12 h LIP 组心肌组织中白细胞浸润数目较 AMI 组减少（P0.05）。见表 3。 表 2 外周血白细胞计数（略）与 AMI 组比较：1）P0.05；下表同42.3 两组 HIF 1、HO 1 mRNA 表达情况 预处理后 1 h HIF 1 mRNA 开始升高，2 h 达高峰，4 h 后开始降低，较对应的 AMI 组有显著性差异（P0.01）。预处理后 HO 1 mRNA 水平上升，1、2、4、6 h 组较对应的心梗组有显著性差异（P0.01）。见表 4。表 3 每组心肌组织中白细胞浸润数量（略）表 4 HIF 1 和 HO 1 mRNA 表达水平（略）与 AMI 组比较
9、：1）P0.013 讨论缺血预处理现象的发现为探索缺血心肌的保护及其机制开辟了崭新的领域，马利等2研究表明 HIF 1 诱导的 HO 1 表达可以减轻缺血再灌注对心肌的损害。HIF 1 是一个由 和 两个亚单位组成的异源二聚体。其中 HIF 1 是结构性亚基，在细胞内的表达水平相对稳定；而 HIF 1 是功能性亚基，其活性和表达水平受氧浓度的影响。Zhu 等3用免疫组化的方法发现早期缺血性改变的区域染色加强,坏死区染色弱。本文观察到急性心肌梗死时 HIF 1 mRNA 表达升高，但在下肢缺血预处理组 HIF 1 mRNA 表达下降，与心梗组 1、2、4 h 组比较有显著差异。这说明 HIF 1
10、 能保护梗死的心肌。HIF 1 可调节多种保护性基因如 HO 1、EPO、Glut 1 和 VEGF 等,与缺氧反应元件(hypoxia response element ，HRE)结合发挥基因调控作用。大鼠 HO 1 基因的 HRE 位于启动子区约 9 kb 处,包括两个功能性 HIF 1 结合位点。在大鼠主动脉平滑肌细胞中,缺氧反应与 HIF 1 和 HIF 1 的浓度增高有关4。Zampino5等5发现冠状动脉结扎后,大鼠 HIF 1 的表达明显增加。这与本实验结果一致。HO 在体内广泛分布，其生理作用是催化血红素降解为胆绿素，后者还原成胆红素，此过程中生成 CO；CO 是重要的气体信使
11、分子，而胆红素是一种抗氧化剂。朱晓光等6观察了大鼠缺血再灌注时骨骼肌中 HO 1 的表达，认为 HO 1 的表达对大鼠骨骼肌的缺血再灌注损伤可能具有保护作用。本研究显示下肢缺血预处理组各个时间点 HO 1 mRNA 的表达高于心梗组对应的各时间点，推测 HO 1可能参与了心肌梗死的发病。上述研究提示，HIF 1 和 HO 1 通过缺血预处理机制对心肌产生保护作用，目前研究认为 HIF 1 是缺血性心脏病发病过程中的关键性调控因子，通过调节缺氧反应基因的转录，达到保护缺血心肌的作用。这种保护作用与受其调控的HO 1 催化游离血红素分解生成的各种代谢产物有关，由于 HO 1 具有可诱导性，提示人为
12、调控 HO 1 的表达在防治心血管疾病方面具有良好的前景。【参考文献】1 Ockaili R，Natarajan R，Salloum F,et al.HIF 1 activation at Tenuates post ischemic myocardial injury：role for heme oxygenase 1 in modulating microvascular chemokine generationJ.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005；289：H542 8.2 马 利，杨 艳，姚尚荣，等.糖尿病大鼠心肌缺血/再灌后低氧诱导因子 1 和血
13、红素加氧酶 1 基因表达的变化J.中国急救医学，2007；27（1）：46 8.3 Zhu BL，Tanaka S，Ishikawa T，et al.Forensic pathologica investigation of myocardial hypoxia inducible factor 1alpha，erythropoietin and vascular endothelial growth factor in cardiac deathJ.Leg Med，2008；10 (1)：11 9.4 Zhen G，Zhang Z，Xu Y.The role of endogenous ca
14、rbon monoxide in the hypoxic vascular remodeling of rat model of hypoxic pulmonary hypertensionJ.J Hua Zhong Univ Sci Tech Med Sci，2003；23(4)：356 68.65 Zampino M，Yuzhakova M，Hansen J,et al.Sex related dimorphic response of HIF 1 alpha expression in myocardial ischemiaJ.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006;291(2)：H957 64.6 朱晓光，周君琳，张克亮，等.大鼠骨骼肌缺血再灌注时血红素氧合酶 1 的表达J.中国修复重建外科杂志，2003；17(1):34 7.
