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1、1siRNA 沉默大鼠 Robo2 对培养 DRGs 神经 元突起生长的影响作者：张海英，刘亦恒，赵久红，张显芳，劳梅丽，易西南【摘要】 目的：观察沉默 Robo2 基因后对体外 DRGs 神经元突起生长的影响。方法：构建大鼠 pSIH1 H1 copGFP Robo2 siRNA 表达质粒，使用慢病毒（lentivirus）包装系统，在 293T 细胞中包装含 Robo2 siRNA 的慢病毒颗粒，然后转染 DRGs 神经元。实时荧光定量 聚合酶链反应（RT FQPCR），Western blot 检测Robo2 mRNA 和蛋白的表达，显微镜下观察 DRGs 神经元突起生长情况。结果：RT
2、 FQPCR 检测 DRGs 神经元中 Robo2 mRNA 的表达量，Robo 组明显低于正常组，具有显著性差异（P0.01）。Western blot 检测 DRGs 神经元中 Robo2 蛋白的表达量，Robo 组明显低于正常组，具有显著性差异（P0.01）。Robo2 siRNA 转入 DRGs 神经元的转导率为 93.01%，与正常组比较，Robo2 siRNA lentivirus 转导细胞（Robo）组轴突生长明显受到抑制。结论：Robo2 蛋白是 DRGs 神经元轴突生长的重要导向分子，可促进轴突的生长。 【关键词】 DRG；Robo2；基因沉默；大鼠ABSTRACT Obje
3、ctive: To observe the silencing Robo2 on growth of DRGs neuronal neurite. Method: Rattus Robo2 siRNA was synthesized and cloned into pSIH1 H1 copGFP plasmid. pSIH1 H1 copGFP Robo2 siRNA lentivirus was generated in 293T cells by pPACKH1TM Lentivector Packaging Kit and transducted into DRG neurons. Th
4、en，the Robo2 were tested by RT FQPCR and Western blot.Results: The expression of Robo2 mRNA and Robo2 protein in Robo2 siRNA lentivirus group were lower than the normal group. The transduction rate of Robo2 siRNA was 93.01% by lentivirus vector. Robo2 siRNA lentivirus group can efficiently suppress
5、neurite growth compared with normal group.Conclusions: Robo2 can promote the growth of neurite of DRG.2KEY WORDS DRG; Robo2；Gene silencing；Rat Roundabout （Robo）是一类与发育有关的保守跨膜受体家族，参与胚胎中枢神经轴突导向，促进树突分支、轴突生长，介导细胞迁移1，2。我们已报道成年大鼠背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）表达 Robo 及 Slit，且周围神经损伤能改变 DRG 内 Robo 的表达，其中 Rob
6、o1 和 Robo2 表达增高3。Robo2 是否参与了再生周围神经突起生长和导向？值得深入研究。本研究拟通过慢病毒载体，把针对 Robo2 基因的小干扰 RNA（small interference RNA, siRNA）体外转染 DRG 神经元，观察对 DRG 神经元 Robo2 表达及突起生长的改变。1 材料与方法1.1 细胞培养大鼠 DRG 神经元的分离培养：SD 大鼠由湖南农业大学实验动物中心提供。无菌条件下取新生 1 周龄 SD 大鼠背根节，F12 冲洗组织数次后，于解剖显微镜下剥离被膜，置 0.125%和 0.25%胶原酶内各消化 30min，接着移入 0.25%胰酶继续消化 1
7、5min，终止消化，在 BSF2（含 F12、1%N2 和 0.3%BSA）中吹打组织，900r/min 离心 5min，去上清，细胞重悬于含 1mL BSF2 的离心管内，在离心管底部添加 2mL 15%BSA，900r/min 离心 10min，去上清，BSF2 重悬细胞，置 24 孔板于 CO2 培养箱中培养。48h 后视细胞贴壁情况更换培养液。1.2 试剂pSIH1 H1 copGFP shRNA vector（System Biosciences, US）、pPACKH1 Lentivector Packaging Kit（System Biosciences, US，LV500A
8、1）、Trizol 试剂(Invitrogen, USA)、RT PCR 试剂盒(Takata，Japan) 、Oligo dT（D511）、 Thermal 3Cycler DicerTM real Time System，Takara，Japan)。1.3 实验方法1.3.1 大鼠 Robo2 siRNA 表达载体的构建采用 pSIH1 H1 copGFP shRNA vector，将 Robo2 siRNA 插入此质粒中，Robo2 siRNA 的序列为：5 GCTGAGGGATTGTCAATAGA 3，阴性对照siRNA 序列为：5CGATTAAGGGTCGCAAG A 3。1.3.2
9、 慢病毒(lentivirus)的包装生产慢病毒包装系统采用 pPACKH1 Lentivector Packaging Kit（LV500A 1），根据试剂盒操作指南，在 293T 细胞中进行包装生产含 Robo2 siRNA 的慢病毒颗粒。1.3.3 慢病毒滴度的测定梯度稀释法测定病毒滴度，在荧光显微镜下计数有荧光表达的细胞数目，将得到的数值(A)除以体积再乘以相应的稀释倍数就得到了病毒原液的滴度值，即：(AV)10n。1.3.4 慢病毒转染 DRG 神经元转导前 1d，取 DRG 神经元以 2103 个细胞接种到 96 孔细胞培养板，转导前对细胞进行换液处理，然后按照 MOI=30 添加
10、病毒液，使用含 10%胎牛血清的F 12 完全培养基，37和 5% CO2 的条件下，将细胞接种到 6 孔细胞培养板，使用不含抗生素的添加 10%胎牛血清的 BSF2 培养基，在 5% CO2 和 37条件下正常培养。转导后 96h，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，计数绿色荧光阳性4细胞，确定转染率。实验分 3 组：（1）正常细胞组（Normal）；（2）阴性对照siRNA lentivirus 转染组（Control）；（3）Robo2 siRNA lentivirus 转染组（Robo）。1.3.5 RT QFPCR 检测 Robo2 siRNARobo2 mRNA 的含量取 2g 总
11、 RNA，按 RTPCR 试剂盒说明书进行操作，合成 cDNA。RT PCR 检测所用引物： actin, Forward primer：5 AGAGGGAAATCGTGCGTGAC 3，Rerverse primer：5 CCATACCCAAGGAAGGCT 3。Robo2，Forward primer: 5 AGTACAGTGCAGGGGTTGG 3，Rerverse primer：5 AGCAAGCCATATAACTGG 3。扩增片段为 326bp。采用下列参数进行差异 PCR：94，50；59，50；72，1min；5 个循环后加入5mmol/LGAPDH 上、下游引物混合液 1L，继
12、续进行 23 个循环终止。采用 Thermal Cycler DICE Real Time System analysis software 对 Ct 值进行定量分析。1.3.6 Western blot 检测 Robo2 siRNA DRG 神经元 Robo2 蛋白的含量取各组细胞，弃培养液，用预冷的 PBS 清洗 3 次，100mm 平皿加 200L 或300L 细胞裂解液，冰面上裂解 20min，15000r，4离心 10min，取上清液，Bradford 法进行蛋白定量(Bio Radproteinassay)。以 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，半干电转移法转移至 NC 膜，室
13、温下用封闭液封闭 2h 后加入一抗(Robo2)多克隆抗体，1250 稀释； 4孵育过夜，抗兔 IgG 二抗（11000 稀释）反应 2h，化学发光法显色，X 射线底片曝光。实验重复 3 次，GAPDH 作为内参照。 1.3.7 神经元突起生长的分析5慢病毒转染后培养 96h，倒置显微镜下观察，各组随机选取 10 个视野，图像采用 Axiovision 软件测量并分析，计算神经元突起的长度（m），同时，在荧光显微镜下，计数 GFP 阳性细胞数，并测量 GFP 阳性细胞突起长度。1.4 统计学处理RT QFPCR 检测结果 Ct 值和神经元突起长度数据用 mean SEM 表示。组间比较采用方差
14、分析检验，两两比较用 t 检验，0.05 认为有统计学意义，统计软件采用 SPSS 10.0 版本。2 结果2.1 Robo2 RNA 干扰后，DRG 神经元 Robo2 mRNA 的表达降低以看家基因 actin mRNA 作为对照，RT QFPCR 检测结果显示，Robo2 siRNA 转入 DRG 神经元后，Robo2 siRNA lentivirus 转染细胞组的 Ct 值明显低于正常细胞组及阴性对照组（0.05）（图 1）。结果说明 Robo2 siRNA 能显著地降低 DRG 神经元中 Robo2 mRNA 的表达。注：Normal：正常细胞组；Control：阴性对照 siRNA
15、 lentivirus 转染细胞组；Robo：Robo2 siRNA lentivirus 转染细胞组。与 Normal 相比较，*P 0.01。2.2 Robo2 RNA 干扰后，DRG 神经元 Robo2 蛋白的表达降低Western blotting 检测结果显示，Robo2 siRNA lentivirus 转染细胞组的 Robo2 蛋白条带灰度不及正常细胞组及阴性对照组（图 2）。说明 Robo2 siRNA 能降低6Robo2 蛋白在 DRG 神经元中的表达。荧光显微镜下观察，转染 96 h 后，DRG 神经元稳定表达 GFP；通过活细胞计数和绿色荧光蛋白表达阳性细胞计数显示转染率
16、为 93.01%（图 3 A、B、C、D）。正常细胞组细胞突起长度均值为（95.1 21.54）m， Robo2 siRNA lentivirus 转染组细胞突起长度均值为（20.04 5.1）m，与正常组比较（P 0.01）。Robo2 siRNA lentivirus 转染组细胞突起明显缩短（图 3 A、C、D、F），并且 Robo2 siRNA lentivirus 转染组中，GFP 阴性细胞的轴突长度（箭头所示）明显长于 GFP阳性细胞轴突，两两比较（P0.01）。Robo2 siRNA lentivirus 转染阳性细胞突起缩短（图 3 C、D、F）。Robo2 siRNA lentivirus 转染组中，GFP 阴性细胞的突起长度与正常组相比，无显著性差异（P0.05）。 （图 3 C、E、F）。3 讨论Slit/Robo 是一类新的排斥性导向分子系统。Robo 作为 Slit 的受体介导 Slit 的排斥作用。Ozdinler 等
