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1、1不同强度恒磁场协同顺铂促进 U2 骨肉瘤 细胞凋亡的分子机制作者：戴闽，詹平，熊高飞，熊建卫【摘要】 目的探讨不同强度恒磁场促进顺铂诱导的 U2 骨肉瘤细胞（U2-OS）细胞凋亡及 p53、bcl-2、c-myc 基因表达变化的情况。 方法分别使用 1 mT、10 mT、100 mT 恒磁场和加入 3.0 g/ml 顺铂的细胞培养液共同培养 U2-OS 细胞 24 h。采用四甲基氮唑蓝比色法（MTT 法）、流式细胞术、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测恒磁场和顺铂联合对 U2 骨肉瘤细胞体外增殖、凋亡及相关基因表达。结果不同强度恒磁场能促进顺铂对人 U2-OS 细胞的抑制作用，10 G
2、s 场强下其抑制率、凋亡率最高；凋亡率达 37.66%，而 p53 mRNA 表达最强，bcl-2、c-myc mRNA 表达最弱。 结论不同强度恒磁场协同顺铂通过诱导细胞内 p53、bcl-2、c-myc 基因表达的变化是其抗肿瘤的机制之一，10 Gs 场强下协同顺铂的抗肿瘤作用最强。 【关键词】 骨肉瘤； 化疗； 恒磁场； 凋亡机制Abstract: ObjectiveTo approach the expression of p53，bcl-2，c-myc genes and apoptosis induced by cisplatin associated with constant
3、magnetic field at different intensities in U2-OS cells. MethodsConstant magnetic field at different intensities (10Gs, 100Gs, 1 000Gs), cell culture fluid including 3.0g/ml cisplatin were used to culture U2-OS cells for 24 h. MTT, RT-PCR, flow cytometry(FCM)were used to evaluate tumor cell prolifera
4、tion,gene expression and apoptosis in vitro.Results Constant magnetic field at different intensities promote the inhibitory effect of cisplatin. The effect of cisplatin with 10Gs constant magnetic field made the maximum inhibition rate and the apoptosis rat. The apoptosis rate was 37.66%. RT-PCR sho
5、wed maximum p53 expression,and minimum bcl-2,c-myc expression.Conclusion Constant magnetic fields at different intensities promote plus cisplatin can induce p53, bcl-2 and c-myc expression. Ten Gs of constant magnetic field has the strongest 2antineoplastic effect.Key words：osteosarcoma; chemotherap
6、y; constant magnetic field; apoptosis顺铂做为一种公认的抗骨肉瘤化疗方案中一线药物，在临床上使用广泛。但越来越多的化疗耐药及对化疗不敏感的病例出现使骨肉瘤治疗疗效停滞不前。通过研究不同强度的恒磁场对顺铂作用的人 U2-OS 细胞凋亡的分子机制，为提高骨肉瘤对化疗的敏感性提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料 （1）细胞来源及其培养：人 U2-OS 细胞株购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，在含 5%CO2、37饱和湿度的培养箱中，用含 10%胎牛血清（杭州四季青公司）的 DMEM 培养基（HyClone 公司）培养，用 0.25%胰蛋白酶（Gibco
7、 公司）消化传代。 （2）药物和主要试剂：顺铂为 Sigema 公司实验用试剂，用生理盐水配制成 1mg/ml 的储存液，使用时用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基稀释成 3.0 g/ml 浓度。噻唑蓝 ( MTT )购于上海普飞生物技术有限公司。DMSO 试剂购于 Sigema 公司。TRIzol 试剂产自 Invitrogen 公司。DEPC 产自 Ameresco 公司。M-MLV Reverse Transcriptase、Rnasin、dNTP、Oligo(dT)15 均产自 Promega 公司。PCR 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.2 方法1.2.1 分组及
8、处理 细胞呈对数生长后，实验分组为：空白对照组；阳性对照组：加入顺铂浓度 3.0 g/ml 的细胞培养液；实验组 1加入顺铂浓度 3.0 g/ml 的细胞培养液+1 mT 恒磁场共培养；实验组 2：加入顺铂浓度 3.0 g/ml 的细胞培养液+10 mT 恒磁场共培养；实验组 3：加入顺铂浓度 3.0 g/ml 的细胞培养液3+100 mT 恒磁场共培养，作用时间为 24 h。1.2.2 四唑蓝比色法（MTT 法） 取对数生长期 U2-OS 细胞经胰酶消化后计数,调整细胞密度为 5104/mL,接种于 96 孔板,每孔 100 L。设调零组、组,每孔设 5 复孔,按上述方法处理细胞后，每孔加入
9、 5 g/L MTT 20 L,继续孵育 4 h,每孔加入 200 L 的二甲基亚砜(DMSO)终止,然后再振荡 15 min, 450 型 ELISA- Reader 酶标仪 490 nm 主波长, 572 nm 副波长检测吸光度。重复实验 3 次。以空白对照组细胞活力为 100%,按公式计算对 U2-OS 细胞增殖的抑制率。公式：细胞抑制率(%)=(1-药物组吸光度/对照组吸光度)100%。1.2.3 流式细胞术检测凋亡 用胰酶消化收集上述各组细胞，应用 FACSCalibar流式细胞仪（Beckton Dickinson ,USA）分析，氩离子激光器激发波长为 488 nm，在流式细胞仪
10、上进行细胞周期分析，得出细胞凋亡百分率。1.2.4 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR 法） 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR 法）检测各组细胞 mRNA 表达（图 1）。采用 Trizol 试剂提取细胞总 RNA，合成 cDNA。 PCR 扩增 p53、c-myc 和 bcl-2 应用 Primer Primier 5 软件设计引物，由上海生工生物工程公司合成, p53 上下游引物分别为 5-TGGAGGATTCACAGTCGG-3及 5-GGTGGAAGCCATAGTTGC-3，扩增产物 187bp；c-my 上下游引物分别为 5- AGAGTTTCATCTGCGACCCG -3及 5-GC
11、TGCGTAGTTGTGCTGATGTG-3，扩增产物 595bp；bcl-2 上下游引物分别为 5-TGTGCCTGTAAACATAGATTCGC-3及 5-CTTCCAGACATCGGAGACCA-3，扩增产物 742bp；同一标本扩增以 -actin 做为内参照。-actin 上下游引物分别为 5- ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3及 5-AGGGGCCGGACGCGTCATACT-3，扩增产物 621 bp。 PCR 通过 94预变性 5 min,94 45 s，55 60 s，72 45 s，354个循环后 72终末延伸 10 min。PCR 产物经 15 g/L 琼脂
12、糖凝胶电泳(含 5mg/L 溴化乙锭)后,在紫外灯下观察结果。通过 FR200 图像分析软件（上海复日公司）读取目的电泳条带的斑点密度扫描值，以各组 -actin 条带的扫描值为标准，测算其相应组的 p53、c-myc、bcl-2 mRNAs 的表达量。1.2.5 统计学方法 采用 SAPSS 13.0 统计软件进行统计分析，实验数据用 x-s 表示，组间比较采用方差分析。2 结果2.1 各组细胞体外增殖抑制实验MTT 检测显示磁场强度为 1 mT 的实验组细胞增殖显著低于对照组及磁场强度为 10 mT、100 mT 的实验组（P0.05）。各组 A 值及抑制率见表 1。表 1 不同强度恒磁场
13、协同顺铂作用后 U2-OS 增殖抑制结果组别*与实验组 2、3 比较有统计学差异，P0.05；与对照组比较有统计学差异，P0.05 2.2 流式细胞仪检测凋亡率组较组凋亡率明显增多（P0.05），组凋亡率分别为0%、21.19%、37.66%、30.71%、27.81%。2.3 RT-PCR 结果各组细胞 p53、c-myc 和 bcl-2 mRNAs 表达量与 -actin mRNAs 条带扫描值对比发现， p53 表达量以组最高；c-myc 和 bcl-2 表达量组最低，组与组比较有组间差异，具有统计学意义(P0.05)。而组与组间比较 p53 表达量增高，c-myc 和 bcl-2 表达
14、量降低，组间比较有统计学意义（P0.05）。5见表 2。图 1p53、bcl-2、c-myc mRNAs 表达图3 讨论骨肉瘤是一种好发于青少年长管状骨干骺端的原发恶性肿瘤，其恶性程度高，致残率、致死率高。虽然自“新辅助化疗”概念提出后，骨肉瘤 5 年的无瘤生存率由原来单纯手术的 20%提高到目前的 70%80%1，顺铂更是骨肉瘤化疗中最常用的药物之一2，但目前骨肉瘤患者的治疗进入了平台期，化疗药物疗效难以提高。随着磁生物学效应研究的开展,人们已经把目光投向了磁场对肿瘤的生物学效应特别是对肿瘤的抑制效应，通过恒磁场及化疗药物的协同作用能否提高化疗药物抗肿瘤作用备受关注。Sabo 等3在研究稳恒
15、磁场对 HL-60 细胞的影响时发现，1T 稳恒磁场作用 72h后不仅可以降低癌细胞的活性,还可以增强抗癌药物对癌细胞的细胞毒作用，但机制尚不明确。Tenuzzo 等4实验表明用 6 mT 恒定磁场处理 HeLa 等多种肿瘤细胞后，检测到肿瘤细胞内 Ca2+离子浓度升高。而 Ca2+离子浓度升高能抑制 bcl-2的表达，促进 bax 蛋白的表达增高，Bcl-2/bax 的比值减小，认为这是诱导肿瘤细胞凋亡的原因之一。刘华等5用全长 P53 cDNA 作探针检测经磁场处理和未经处理的肿瘤细胞 p53 基因扩增、重排、缺失、转录和表达时发现：恒强磁场引起的荷瘤大鼠肿瘤细胞凋亡同 p53 基因转录和
16、表达增强有关，表现出 P53 依赖性凋亡的特点。这些研究反映了磁场作用于基因而间接影响肿瘤增殖和凋亡状态的作用路线。表 2 RT-PCR 结果分析表空白对照组阳性对照组实验组 1 实验组 2 实验组3p53/-actin0.5140.0080.6650.0090.6840.007*0.6420.0080.5910.007bcl-2/-6actin0.6810.0140.6240.0100.4610.003*0.4920.0060.5500.005c-myc/-actin0.8830.0070.7680.0040.6370.002*0.6800.0070.6460.003* 与其他各组比较均有统计学差异，P0.05 本研究发现，不同强度稳恒磁场协同顺铂作用于 U2-OS 细胞 24 h 能促进细胞凋亡的发生，这种作用是通过促进 p53
