《TGF-β和BDNF联合诱导成年大鼠BMSC向神经样细胞分化的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《TGF-β和BDNF联合诱导成年大鼠BMSC向神经样细胞分化的研究（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1TGF- 和 BDNF 联合诱导成年大鼠 BMSC 向神经样细胞分化的研究作者：梅晰凡，吕刚，王岩松，李全双，郭占鹏【摘要】 目的 探讨转化因子 (TGF-)和脑源性神经生长因子(BDNF)联合诱导成年大鼠骨髓基质细胞成神经细胞的可能性，为神经再生及脊髓损伤的治疗提供一种新方法。方法 从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞并传至第 5 代，诱导前 2 h先用含 1 g/L 转化因子（TGF-）及 20%FBS 的 DMEM 培养液培养，以促进细胞分裂，然后用脑源性神经生长因子(BDNF)作诱导剂，观察细胞形态的变化，并采用免疫组织化学法检测诱导后的细胞表达 NF，NSE，GFAP 等特异性标志物。
2、结果 诱导后 5 h，部分细胞的形态已发生改变，12 h 后大部分细胞不仅在形态上表现为神经元样特征，而目 NF 及 NSE 等特异性抗体呈阳性表达，而 GFAP 抗体表达呈阴性。结论 转化因子 (TGF-)和脑源性神经生长因子(BDNF)能将骨髓基质细胞诱导成神经元样细胞。 【关键词】 骨髓基质细胞；转化因子 ；脑源性神经生长因子；细胞分化；神经元样细胞Abstract：Objective To study the possibility that transforming growth factor- and brain-derived neurotrophic factor induce
3、s adult rat bone marrow stromal cells(BMSCs) into neurons, and provide a new method for neuron regeneration and the treatment of spine cord injury. Methods The bone marrow stromal cells from adult rats were isolated and cultured for 5 passages. The BMSCs were incubated with DMEM containing 20% FRS a
4、nd TGF-(1g/L )for 2 hours. Then the media were replaced by DMEM media consisting of BDNF(50g/mL). The morphological changes of the cells were observed under phase contrast microscope，the cells were stained immunocytochemically with NF，NSE and GFAP antibodies respectively. Results After 5 hour of ind
5、uction with neurotrophic factor, some cells showed morphological 2changes, and 12 hours later,many BMSCs became neuron-like cells and were stained positively with NF，NSE antibody，but negatively with GFAP.Conclusions The bone marrow stromal cells can differentiate into neuronlike cells by the inducti
6、on of transforming growth factor-and brain-derived neurotrophic factor.Key words：bone marrow stromal cells；transforming growth factor-；brain-derived neurotrophic factor；cell differentiation induction；neuron-like cells近年来的基础研究发现脊髓损伤后采用组织工程方法，将有活性的种子细胞移植治疗脊髓损伤，能促使损伤轴突修复、再生和恢复脊髓部分神经功能，骨髓基质细胞（MSC）可为基因治疗
7、神经系统的疾病提供良好的载体1。骨髓基质细胞诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞及神经细胞的研究也见报道，为了探讨转化因子 和脑源性神经营养因子对骨髓基质细胞向神经细胞联合诱导分化的可能性和条件，为以后神经细胞再生和脊髓内移植的研究奠定基础23，本研究观察了转化因子 （transforming growth factor-，TGF-）和脑源性神经营养因子( brain-derived neurotrophic factor, BDNF)对成年大鼠骨髓基质细胞的诱导分化作用，现报告如下。1 材料与方法1.1 主要试剂和仪器TGF- 和 BDNF 购自 Sigma 公司，小鼠抗特异性神经元烯醇化酶( NS
8、E)单抗，小鼠抗神经丝蛋白(NF)单抗，小鼠抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单抗购自华美公司, FITC 标记羊抗小鼠 IgG 购自 Gibco 公司，SABC 试剂盒购自武汉博士德公司。主要仪器：Olympus CK40 倒置显微镜，Olympus BX51 荧光显微镜。SD 大鼠由锦州医学院实验动物中心提供。1.2 骨髓基质细胞的分离及培养3梅晰凡，等：TGF- 和 BDNF 联合诱导成年大鼠 BMSC 向神经样细胞分化的研究辽宁医学院学报 2008 年 10 月，29(5)SD 大鼠雌雄不限，130 g 左右，将其拉颈处死，75%酒精浸泡 10 min，无菌条件下取出股骨，除去骨周围的肌肉
9、组织，剪开骨两端，显露骨髓腔，用 10 mL 注射器，以 IMDM 培养液从一端冲洗骨髓腔，将骨髓冲到平皿中，用吸管反复吹打含有骨髓的冲洗液使其成为单细胞悬液，后用150 目尼龙网过滤，滤液常温下 1000 rpm 离心 10 min，弃上清，沉淀内加入红细胞裂解液(每只鼠骨髓内加入 1 mL)置常温下 2 min，后加入 IMDM 培养液 10 mL，吹散后 1000 rpm 离心 10 min，弃上清后向沉淀内加入 IMDM 含 10%FBS 培养液 10 mL，吹散后计数，将细胞稀释后按 8 000 个细胞cm2 接种于 25 cm2 培养瓶，于 37 5CO2 及饱和湿度下培养，相差显
10、微镜下观察细胞生长状况，分别于培养的第 4、10、17 天半量更换培养液，去除未贴壁细胞4，第 20 天以0.25胰蛋白酶消化传代得到骨髓基质细胞接种于培养皿中，培养皿内置经多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）防脱片处理的盖玻片。1.3 转化因子 和脑源性神经营养因子联合诱导鼠骨髓基质细胞上述细胞传代至第 5 代后继续培养，加入含 1 g/L 转化因子（TGF-）预诱导 2 h，然后用含 50 g/mL 脑源性神经生长因子（BDNF）的 IMDM 念 20%FBS 培养基地 37 5%CO2 及包和湿度下培养骨髓基质细胞对其进行分化诱导；以单纯IMDM 含 20%FBS 培养基同等条件培养
11、作对照 1；并以含 1 g/L TGF- 的 IMDM含 20%FBS 培养基同等条件培养作对照 2；并以含 50 g/mL BDNF 的 IMDM 含20%FBS 培养基同等条件培养作对照 3。相差显微镜下观察细胞形态变化，培养 3天后，吸弃培养液，0.01 M PBS 冲洗 3 次，4 丙酮固定-70 保存备免疫细胞化学染色。41.4 转化细胞的鉴定和转化率的测定吸弃培养皿内的培养液；纯丙酮室温固定 2030 min，蒸馏水洗，干燥后可冰冻保存；冰冻切片从冰箱内取出，恢复至室温，PBS 冲洗 3 次；纯甲醇加 H2O2 至0.5%，室温浸泡 30 min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗
12、3 次；滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 min，甩去多余液体，不洗；滴加适当稀释的一抗（小鼠 IgG），其中小鼠抗大鼠 NSE(-)抗体稀释度为 1100，小鼠抗大鼠 NF 抗体稀释度为1200，对照实验以 0.01 M PBS 液代替抗体，37 3060 min 或 20 60120 min，也可 4 过夜；0.01 M PBS 洗 2 min3 次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，2037 20 min。0.01 M PBS 洗 2 min3 次。滴加试剂 SABC，203720 min。0.01 M PBS 洗 5 min4 次，DAB 显色：使用 DAB 显色试剂盒（ED1022），
13、取1 mL 蒸馏水，加试剂盒中 A，B，C 试剂各 1 滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间，一般在 530 min 之间，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染，逐级脱水，透明，封片。光镜下观察，随机选取 5 个视野，每个视野计数 200 个细胞，计算阳性细胞数目。2 结 果2.1 大鼠骨髓基质细胞生长情况刚接种时细胞种类较多，包括造血干细胞及分化程度不同的其它各系血细胞、骨髓基质细胞等，散在悬浮于培养液内。培养 12 天后，骨髓基质细胞开始贴壁，经过数次换液后，未贴壁的细胞逐步被清除，培养 10 天时，细胞以造血干细胞和骨髓基质细胞等贴壁生长的细胞为主5；培养 20 天后，大多数造血干细胞死
14、亡，5剩下的主要是骨髓基质细胞。典型的骨髓基质细胞的形态特点是：型细胞较少，梭形，70 m8 m 大小，胞核 20 m5 m 大小；型细胞为主要类型，形态差异较大，胞体大而扁平，3050 m 大小，有突起，胞核圆形，直径 1520 m，立体感不强，胞浆淡染。同时，混有少量造血干细胞。2.2 诱导后的形态变化骨髓基质细胞经过转化因子（TGF-）预诱导 2 h 后，细胞形态变化不大，但细胞的胞体变大，BDNF 诱导 5 h 后，部分细胞分化，胞体向胞核收缩呈锥形，有折光性，有较多的长突起，交织成网状，类似神经元样细胞。此时细胞无明显增殖现象。而未加人 BDNF 的对照组细胞形态基本保持原来的形态不
15、变6-7。12 h 后大部分细胞不仅在形态上表现为神经元样特征，细胞突起之间似发生联系，变化呈渐进性（图 1-6）。 2.3 大鼠骨髓基质细胞分化后的鉴定和转化率的测定神经样细胞的胞体和突起 NSE(-)和 NF 染色呈强阳性，而未分化的骨髓基质细胞为阴性。定量计数分析实验组表达 NSE(-)约为(69.63.8)%，表达 NF 约为(70.63.3)%。对照 1 组基本不表达 NSE(-)和 NF，对照 2 组少量表达 NSE(-)和 NF（5%），对照 3 表达 NSE(-) 约为(42.62.9)%，NF 约为(43.63.1)%， （见表 1）。表 1 实验组与对照组比较 NSENF
16、实验组*P0.05 与对照组 1 比较3 讨 论3.1 骨髓基质细胞诱导分化对脊髓损伤治疗的意义中枢神经系统神经损伤后，由于内在的再生能力差和外在的微环境的抑制，轴突再生一直是脊髓损伤修复的“瓶颈”。随着近年来干细胞研究逐渐成为生命科学领6域中继基因工程后新的全球生物高新技术焦点和热点，作为干细胞之一的BMSCs。因其潜力的逐渐开发而显其独特优势，在脊髓损伤中表现突出：它能促使损伤轴突修复、再生和恢复脊髓部分神经功能，MSC 能从患者自体不断获得，诱导分化为神经干细胞后自体移植免疫排斥反应弱，同时又避免了伦理问题困扰，克服了从脑组织中获得神经干细胞的采集困难、易造成神经功能缺失等缺陷，使其适用于临床个体化治疗。骨髓基质细胞除了提供细胞外基质，支持和调节造血干细胞的自我更新和分化外，本身还具有很强的增殖力和多向分化的潜能。MSC诱导分化为神经细胞，移植后治疗脊髓损伤是目前最
