《茎用芥菜细胞质雄性不育相关基因的克隆及机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《茎用芥菜细胞质雄性不育相关基因的克隆及机制研究（105页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、浙江大学博士学位论文茎用芥菜细胞质雄性不育相关基因的克隆及机制研究姓名：杨景华申请学位级别：博士专业：蔬菜学指导教师：张明方;喻景权20060401杨景华：茎用芥菜细胞质雄性不育相关基因的克隆及机制研究致谢本论文的研究工作是在张明方教授和喻景权教授两位导师的悉心指导下完成的。两位先生严谨的治学态度和谆谆教诲，将使我受益终生。在完成论文的过程中，两位先生倾注了大量的心血和精力，并在生活上给予我无微不至的关怀和帮助，值此论文答辩之际，向导师致以最诚挚的谢意。该论文能够顺利完成，是与许多人对我生活和学习的不断关心和鼓励分不开的。在五年的学习期间，得到了园艺系曹家树教授、朱祝军教授、汪炳良教授、陈利萍
2、副教授、卢刚副教授、叶纨芝老师、余小林老师、向殉老师、钱琼秋老师和周艳红老师以及生物所陈卫良副教授及黎军英老师等的指导和帮助。感谢日本东京大学M i k oN a k a z o n o 博士在论文研究思路上的热心帮助和启迪。感谢中国科学院上海植物生理生态研究所黄继荣研究员提供野生型拟南芥及遗传转化方法。感谢山东农业大学孟庆伟教授、李滨副教授等以及温州大学杨家付老师在学习和生活上的关心和帮助。感谢齐晓花、朱雪云、师凯、傅丰庆等博士，杨国志、李水风、贾世燕、张硕、许智颖、缑艳霞、高媛、千春录、王艳菊、葛亚民、管学玉、马胜、赵曼、张莉等硕士在学习与实验过程中的大力协助。同时感谢好友张家祥及向庆宁、
3、李志凌等师兄、叶素芬、黄黎峰等博士、张全美、于天祥、朱隆静等同学、闰静、付杰、徐春霞和李春顺等师弟师妹的关心和帮助。感谢所有支持和帮助过我的老师、同学和朋友。由衷感谢多年来一直关爱和支持我的家人和朋友。感谢刘训言女士在学习、生活及实验过程中的悉心帮助。栖景华2 泓年? 月于华家池C M SN a O A Cb p L B m R N A C a M V 3 5 SA m pE c o I P T GC T A BT r i sT EP C RS D Sd d H 2 0E BC r bK m6 B AN A A M SB S AM O P SR r - P C RS S Cs s D N AM
4、 - n 、L R TE D T Aa n ) Aa 中0a t D 6a l p 9 m d l m d 2a d 3n a d 4n a d 4 Ln a d 5n a d 6n a d 7n a d 9英文缩写符号及中英文对照表C y t o p l a s d cm a l es t e r i l i t y S o d i ma c 咖t eB e D 斑L u r i a b e r t a n im e d i 砌M e S s a 璺eR N AP r o n l o C e ro f c a 【1 1 i n o w e rm O s a i cv i r u sA m D
5、 i c i l l i nE s c h e r i c l l i ac o l iI s o p r o p y l t h i o B - D 唱a l a c t o s i d e C e t v l 幽e t l l v l a m m o I l i u mb r o I I l i d eT r i s h y d r y x ”n e t l l y1 孤I l i I l 啪e t h 如e1 h s C l - E D l Ab 皿醯P o l y m e r a s ec h a i nr e a c n o n S o d i 岫d o d e c v ls u l
6、 f a t eD i 曲1 】e da I l dd e i o 毗dw a t e rE t h i d i u mb m m i d eC a I b e l l i c i l l i I l l 渤a m v c i n6 - b e n z v l a d e n i n eN a D h t l l a l e n ea c e t i ca c i dM u m s h i g ea n dS “l gm e d i B o v i n es e m ma l b u m i I l3 州_ 埘o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l f
7、b I l i c R e v e r s et r a n s c r i D t i o nP C R S t a n 捌s a l i l l ec i 仃a t eS a l m o ns 口e m lD N AM o l o n e vM u 血l eL e l l k e I i av i m sd i s o d i 岫c m v I e n e d i a I I l i n e t e 咖c e t a t eos u b u n i to fA = r P a s eBs u b u n i to f A T P a s es u b u I l i t6o f A T P
8、 a s e蚰b u n i t9o fA ：r P a s es u b u n j t1o f N A D Hs u b u n i t2o f N A D Hs u b u n i t3o f N A D Hs u b u n n4o f N A D Hs u b u I l i t4 Lo f N A D Hs u b u n “5o f N A D Hs u b u n i t6o f N A D Hs u b u I l i t7o f N A D Hs u b u n i t9o f N A D H2细胞质雄性不育醋酸钠碱基对L B 培养基 信使R N A花椰菜花叶病毒3 5 s
9、 启动子氨苄青霉素大肠杆菌异丙基一B D 硫代半乳糖苷十六烷基三乙基溴化铵三羟甲基氨基甲烷T r i s C l E D T A 缓冲液聚合酶链式反应十二烷基硫酸钠重蒸水溴化乙锭羧苄青霉素卡那霉素6 苄基腺嘌呤蔡乙酸 M s 培养基牛血清蛋白3 ( N 吗啉代) 丙磺酸反转录P c R标准柠檬酸盐溶液 鲑精D N A重组鼠成白血病毒逆转录酶乙二胺四乙酸二钠盐 线粒体A T P 酶复合体n 亚基线粒体A T P 酶复合体B 亚基 线粒体A r P 酶复合体亚基6线粒体A T P 酶复合体亚基9线粒体N A D H 脱氢酶亚基l 线粒体N A D H 脱氢酶亚基2线粒体N A D H 脱氢酶亚基3
10、 线粒体N A D H 脱氢酶亚基4线粒体N A D H 脱氢酶亚基4 L线粒体N A D H 脱氢酶亚基5 线粒体N A D H 脱氢酶亚基6线粒体N A D H 脱氢酶亚基7 线粒体N A D H 脱氢酶亚基9杨景华：茎用芥菜细胞质雄性不育相关基因的克隆及机制研究c o xIc 湖r D s 3a C n n0 nB i A P 3B P IB j A GB j s P LR A C Es u b u n i t1o f c v t o c l l 】m eo x i d a s es l l b u n i t3o fc y t o c h r o I n eo x i d a s er
11、 i b o s o m ep r o t e i 3a c t i O p e nr e a d i n g 丘咖e A P E T A L A 3g e n ei nB r 跚i 扣n c 阳P I s T I L I ，A T Ag e ei nB 阳s r 妇扣玎c 阳 A G A M O U Sg e n ei 1 1 B ，缸站泐扣n c 阳S P O R O C Y T E L E S Sg e n ej 丑九z r s 泐豇月c 阳r 印i d 叩1 m c 撕0 c N D Ae n d3线粒体细胞色素氧化酶亚基1线粒体细胞色素氧化酶甄基3核糖体蛋白3 基因肌动蛋白开放阅读框
12、茎用芥菜A P E T A L A 3 基因茎用芥菜P I s T I A T A 基因茎用芥菜A G A M O U S 基因茎用芥菜s p o m c y t e l e s s 基因 快速扩增c D N A 末端鱼塑翌查堂堡主兰堡垒壅摘要中国芥菜( B r 伽如口皿H 咖c o s s ) 是我国的特产蔬菜，在我国南北方都有种植，尤其是浙江、四川等地有广泛的栽培，是世界著名的腌菜之一，经济价值比较大，是重要的加工蔬菜。芥菜以其富含营养成分著称，丰富的维生素、氨基酸、抗氧化物质以及多聚不饱和脂肪酸等等，深受人们的喜爱，然而，生产上确存在许多问题，如病毒病及品质差等，严重影响生产实践。杂种优
13、势的利用往往可以在一定程度上解决这些问题，由于芥菜类作物自交亲和指数非常高，生产上很难利用自交不亲和系进行杂种优势利用，因此，一直以来，雄性不育性是芥菜类作物杂种优势利用的重要途径。细胞质雄性不育由于其可以获得1 0 0 不育度和不育率的材料，因此，在中国芥菜优势育种中有着广阔的应用前景。陈竹君、张明方等( 1 9 9 3 ，1 9 9 5 ) 通过远缘杂交和回交的方法选育了综合经济性状优良的茎用芥菜细胞质雄性不育系( c y t o p l a s r n j cm a l es t e m n y ，C M S 系) ，并开始应用于生产。细胞质雄性不育分子机制的研究，不仅可从理论上阐明线粒
14、体基因组和核基因组的互作关系，研究高等植物的生殖发育等，也为对线粒体基因组基因进行分子生物学操作及今后利用基因工程创造雄性不育新种质及寻求缩短胞质不育选育的进程与途径提供理论依据。本研究以茎用芥菜细胞质雄性不育系及其保持系为材料，通过比较研究，寻找与茎用芥菜细胞质雄性不育相关的基因，并研究不育性产生分子机理，从线粒体基因组与核基因组互作角度阐明不育性产生的途径，主要结果如下：1 通过同源克隆方法克隆到了茎用芥菜胞质不育候选基因o ，口2 D ( G e n e b a n k注册号A Y 2 0 8 8 9 8 ) ，进一步分析表明，o 啦2 D 基因推定编码膜相关的蛋白质，在氨基酸水平上，与
15、。啦、D 棚刀和。班粥等芸薹属中发现的不育相关基因推定的氨基酸同源性分别为7 4 、7 6 和3 8 ，此外，D 啦2 D 推导的蛋白氨基端序列 与0 8 n D 腩e m 6 9 胞r 如n n 中的C O x ( 线粒体细胞色素氧化酶复合体亚基) 、萝h中的A T P 8 ( 线粒体A T P 酶复合体亚基) 以及向日葵中的O 砌礓( A T P 酶复合体a 亚基相关) 蛋白氨基端序列同源性也非常高。D 啦2 D 基因在茎用芥菜胞质不育系中为低拷贝基因，在根、叶、花蕾及开放的花中都有表达，无器官特异性。2 通过对茎用芥菜胞质不育系及其保持系线粒体基因组的比较研究，发现了线粒体砷叫基因在不育
16、系及其保持系之间存在明显差异。保持系中啦叫基因2 2 6 9b D 长，推定编码5 0 7 个氨基酸，具有A T P 酶复合体典型及活性必要的结构域( G e n 曲a 1 1 k 注册号A Y 2 1 1 2 6 6 ) ，进一步分析表明，保持系别基因推定编码的氨基酸序列比较保守，甚至与水稻中叻叫基因推定编码的氨基酸同源性为9 0 ，进化角度分析表明，茎用芥菜中克隆的砷叫基因与在芜菁、萝h 、甘蓝4杨景华：茎用芥菜细胞质雄性不育相关基因的克隆及机制研究型油菜和拟南芥中克隆的脚叫基因亲缘关系比较近。而不育系中确州基因2 6 1 8b p 长，推定编码4 2 9 个氨基酸，此外，在不育系砷埘基因5 、u T R 区域有一段3 8 3b p 的插入序列( G e e b a l l k 注册号A Y 2 1 1 2 6 5 ) 。然而叻叫基因在不育系及其保持系中，具有相同的推定的启动子序列( A A A T A T C A T 髓A G A G A A G A A G A ) 、转录起始位点
