《T细胞CTLA-4、TCRVβ8基因克隆、重组及表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《T细胞CTLA-4、TCRVβ8基因克隆、重组及表达（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1T 细胞 CTLA-4、TCRV8 基因克隆、重 组及表达作者：王晶，朱江，朱本章，马卫国【摘要】 目的 克隆 Graves病患者甲状腺组织 T 淋巴细胞的 CTLA-4 胞外段和TCRV8 目的基因，重组为 CTLA-4-TCRV8 基因并表达出融合蛋白。方法 RT-PCR 从 Graves病患者甲状腺组织中克隆 T 淋巴细胞的 CTLA-4 胞外段和TCRV8 基因，依次与表达质粒进行连接，双酶切及测序鉴定获得正确的重组子；原核表达融合蛋白，SDS-PAGE 及 Western-Blotting 检测蛋白表达情况。结果 基因克隆扩增出 CTLA-4 和 TCRV8 目的基因片段，测序结果
2、证实序列与已发表的一致。重组基因原核表达出与预期分子质量大小相符的目的蛋白。结论 成功构建和表达了 CTLA-4TCRV8 基因，为探索 Graves病免疫耐受治疗提供了基因产品 【关键词】 Graves病；CTLA-4；TCRV；基因表达；融合蛋白ABSTRACT: Objective To clone CTLA-4 and TCRV8 gene from T lymphocyte of thyroid of Graves disease (GD) patients, recombine to form CTLA-4-TCRV8 fusion gene and express the fus
3、ion protein. Methods CTLA-4 and TCRV8 gene was cloned from T lymphocyte of thyroid of GD patients by RT-PCR. Then it was recombined with expression plasmid in order. The correct plasmids were obtained after the restriction analysis and DNA sequencing. Prokaryotic expression of the fusion protein in
4、E.coli, SDS-PAGE and Western Blotting were used to verify the fusion protein. Results Restriction analysis and DNA sequencing confirmed the correct sequence and insertion site of the recombinant plasmid. The recombinant fusion protein was successfully expressed in E.coli, which was consistent with t
5、he predicted putative calculating molecular weight. Conclusion CTLA-4-TCRV8 gene was constructed and expressed successfully, providing gene product and application theory for immune tolerance therapy of GD.KEY WORDS: Graves disease(GD); CTLA-4; TCRV8; gene expression; fusion 2proteinGraves病(Graves d
6、isease, GD)是一种器官特异性自身免疫性疾病，是甲状腺功能亢进症中最常见的类型。自身免疫病的 T 细胞活化需要双信号刺激，阻断第一信号则特异性免疫应答不能发生，阻断协同刺激信号，T 细胞则进入无反应状态或发生凋亡。细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4(CTLA-4)是下调或终止 T 细胞反应的重要协同刺激分子1，CTLA-4Ig 能有效阻断免疫反应，诱导免疫耐受，但缺乏特异性2。研究发现 Graves病患者甲状腺组织浸润 T 淋巴细胞为寡克隆性3，存在某些 TCRV 或 TCRV4基因家族亚型基因的优势利用现象，其中TCRV8 为 TCRV 优势利用基因之一5。基因重组、表达 CTLA-
7、4-TCRV8 融合蛋白，既利用 TCRV8 优势基因产物阻断 TCR 对特异性抗原的识别，又利用CTLA-4 阻断协同刺激信号，以达到同时阻断 T 细胞激活依赖的双信号作用，从而抑制或避免甲状腺特异性 T 细胞活化，来解决或部分解决 CTLA-4 诱导免疫耐受的特异性问题。本实验构建了 pcDNA3.1()-CTLA-4-TCRV8 质粒，并在大肠杆菌中诱导其表达，初步验证了融合蛋白的生物活性。1 材料与方法1.1 主要试剂pcDNA3.1()、pET28a()质粒由本校免疫病理教研室提供，Trizol 购自Invitrogen 公司，反转录试剂盒购自 MBI 公司，Taq 酶购自 Stra
8、tagene 公司，dNTP购自 Toyobo 公司，各种限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自 TaKaRa 公司，PCR引物由上海生工公司合成，质粒提取试剂盒购自 Omega 公司，胶回收试剂盒购自U-gene 公司，小鼠 Anti-His Antibody、HRP-羊抗鼠 IgG 多克隆抗体购自华美生物工程公司。31.2 方法1.2.1 RNA 提取和 cDNA 合成用 Trizol 法提取 Graves病患者甲状腺组织 T 淋巴细胞 mRNA。按 MBI 逆转录试剂盒说明书逆转录反应获取 cDNA。1.2.2 PCR 扩增 CTLA-4 的基因片段根据 GenBank 中 CTLA-4
9、 胞外段的基因序列(基因文库号：L15006)设计引物。上游：5-CTGGATCCGCCGCCACATGGCTTGCCTTGGATTTC-3；下游：5-CAGAATTCAGAATCTGGGCACGGTTC-3，含 BamH和 EcoR酶切位点，同时上游引物 5端加入 Kozak 序列。PCR 反应按本室常规方法进行，PCR 产物用 15 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.3 重组质粒 pcDNA3.1(+)-CTLA-4 的构建 CTLA-4 基因片段和pcDNA3.1(+)质粒经 BamH和 EcoR双酶切后，回收酶切片断。用 T4 DNA 连接酶连接。连接产物转化 E.coli DH5，
10、提取质粒，进行双酶切及测序鉴定获得正确重组质粒。1.2.4 PCR 扩增 TCRV8 的基因片段根据 GenBank 中 TCRV8 的基因序列(基因文库号：X00437)设计引物。上游：5-CTGAATTCATGGACTCCTGGACCTT-3； 下游：5-CACTCGAGCTACTCACTCACGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG-3，含 EcoR和 Xho酶切位点，同时下游引物 5端加入能适应三种不同读码框架的终止密码子。PCR 反应按本室常规方法进行，产物用 15 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测。41.2.5 重组质粒 pcDNA3.1(+)-CTLA-4-TCRV8 的构建 T
11、CRV8 基因片断和 pcDNA 3.1(+)-CTLA-4 质粒经 EcoR和 Xho双酶切后，回收酶切片段。用 T4 DNA 连接酶连接。连接产物转化 E.coli DH5，提取质粒，进行双酶切及测序鉴定获得正确重组质粒 pcDNA3.1(+)-CTLA-4-TCRV8。1.2.6 PCR 扩增 CTLA-4-TCRV8 目的基因片段从正确的重组子 pcDNA3.1(+)-CTLA-4-TCRV8 上扩增。上游引物：5-CTGGATCCATGGCTTGCCTTGGATTTC-3；下游引物：5-CACTCGAGGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG-3，含 BamH和 Xho酶切位点
12、。PCR 产物用 12 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.7 重组质粒 pET28a(+)-CTLA-4-TCRV8 的构建 CTLA-4-TCRV8 目的基因片段和 pET28a(+)质粒经 BamH和 Xho双酶切后，回收酶切片段。用 T4 DNA 连接酶连接。连接产物转化 E.coli DH5，提取质粒，双酶切及测序鉴定获得正确重组子。1.2.8 融合蛋白的原核表达将测序获得的正确重组子转化 BL21(DE3)株。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度 1mmol/L，诱导表达 4 h，离心收集菌体。100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白表达情况。1.2
13、.9 Western-Blotting 检测 将少量已诱导的工程菌行 SDS-PAGE 电泳，然后在冰浴条件下将蛋白转印至硝酸纤维膜上，小鼠 Anti-His Antibody 为一抗，HRP-羊抗鼠 IgG 多克隆抗体为二5抗，DAB 显色检测目的蛋白并扫描记录实验结果。2 结果2.1 CTLA-4 基因片段的获得与预期结果相符合的 504 bp 条带(图 1)。2.2 重组质粒 pcDNA3.1(+)-CTLA-4 的双酶切鉴定经 BamH和 EcoR双酶切后，可得到 5.4 kb 和 504 bp 两个片段，证实为CTLA-4 插入 pcDNA3.1(+)(图 2)。2.3 序列分析经测
14、序证实，质粒 pcDNA3.1(+)-CTLA-4 中 CTLA-4 基因序列与文献6报道的 CTLA-4 胞外区 cDNA 序列一致，无碱基突变、缺失和移码突变，且外显子 1第 49 位基因多态性位点为 G7。 2.4 TCRV8 基因片断的获得与预期结果相符的 628bp 条带(图 3)。2.5 重组质粒 pcDNA3.1(+)-CTLA-4-TCRV8 的双酶切鉴定经 EcoR和 Xho双酶切，可得到 5.9 kb 和 628 bp 两个片段，经 BamH和EcoR双酶切后，可得到 6.0 kb 和 504 bp 两个片段。证实为 TCRV8 插入pcDNA3.1(+)-CTLA-4(图
15、 4)。2.6 序列分析6经测序证实，重组子 pcDNA3.1(+)-CTLA-4-TCRV8 中 CTLA-4 基因序列未见碱基突变、缺失和移码突变，TCRV8 基因序列与文献8相符，通过基因文库同源比较证实属于 TCRV8 亚家族。序列中的黑体背景字为酶切位点 BamH、EcoR和 Xho，粗体字为 Kozak和终止密码。2.7 CTLA-4-TCRV8 基因片段的获得从正确的重组子 pcDNA3.1(+)-CTLA-4-TCRV8 上经 PCR 扩增出与预期结果相符的 1 098 bp 目的条带(图 5)。2.8 重组质粒 pET28a(+)-CTLA-4-TCRV8 的双酶切鉴定 经
16、BamH和 Xho双酶切，可得到 5 kb 和 1 098 bp 两个片段，证实为CTLA-4TCRV8 插入 pET28a (+)中(图 6)。2.9 序列分析经测序证实，重组子 pET28a(+)-CTLA-4-TCRV8 基因序列与预期相符，无碱基突变、缺失及移码突变。2.10 CTLA-4-TCRV8 融合蛋白的原核表达2.10.1 SDS-PAGE 电泳结果在分子质量为 43 ku 处有一条明亮带，与预期相符(图 7)。3 讨论7为了使融合蛋白能够高效表达，本实验在起始密码子上游插入了一个内含子Kozak 序列。在 CTLA-4 和 TCRV8 两段基因的连接顺序上，由于 CTLA-4 的基因序列恒定不变，TCRV 在结构上分为恒定区(C 区)和可变区(V 区)两部分，V 区中尤其是高变区中的 CDR3 具有更高的高变程度，是独
