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1、1MMP2、MMP9 和 VEGF 在肾癌中的表 达与临床意义作者：卜宏民 王连渠 闫拥军 焦志灵 徐国良 【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶2、9(MMP2、MMP9)与血管内皮生长因子（VEGF）在肾癌组织中的表达与临床分期的意义。方法 蛋白免疫印迹法、ELISA 和逆转录聚合酶链反应法（RTPCR）检测癌组织 MMP2、MMP9，蛋白质免疫印迹法和 RTPCR 检测癌组织 VEGF。结果 肾癌组织中MMP2、MMP9 和 VEGF 明显表达，随着病程的进展 MMP2、MMP9 和VEGF 活性逐渐增高，以期晚期最明显，VEGF 与 MMP2、MMP9 表达具有正相关性。结论 MMP2、M
2、MP9 和 VEGF 参与了肾癌临床病情进展和发病机制。 【关键词】 肾癌；基质金属蛋白酶；血管内皮生长因子基质金属蛋白酶(MMP2 和 MMP9）及其组织抑制物因子(TIMPs)在恶性肿瘤浸润转移中的作用已成为研究热点1，2，其中能够水解基底膜主要成分型胶原的 MMP2(明胶酶 A)、MMP9(明胶酶 B)由于参与了细胞外基质(ECM)的降解和血管的发生，被认为在恶性肿瘤的浸润转移中发挥重要的作用2。血管内皮生长因子（VEGF）是一种增加血管通透性并促进新血管生长的细胞因子，在许多恶性肿瘤呈高表达并与侵袭转移和预后等生物学行为关系密切，可能与肿瘤及肿瘤转移灶的生长中的血管生成有关3，4。但三
3、者在肾肿瘤组织中表达及其关系的文献报道的还不多，本文检测了肾癌组织中 MMP2、MMP9 和 VEGF 的表达，探讨其与肾癌临床分期的关系与意义。21 资料与方法1.1 一般资料 67 例肾癌标本取自 2004 年 1 月2007 年 10 月在本院外科手术切除的肾癌患者。其中男 33 例，女 34 例，年龄 3682（平均 5418.5）岁。按国际抗癌联盟(1987 年)，TNM 分期：其中 I 期 4 例，期 27 例，期 30 例，期 6 例。全部患者均经手术及病理证实。所有患者术前均未行放、化疗，手术标本取材后立即放人液氮罐保存。肾癌临床分期标准根据肾壁增厚程度及是否外侵、有无远处转移
4、，可将肾癌分为 4 期，期(即早期)：腔内肿块或局限性肾壁厚(35 mm)；期：肾壁厚5 mm，但未侵及纵隔，也无远处转移；期：肾壁厚5 mm，侵犯周围组织，也可以有纵隔淋巴结肿大，但无远处转移；期：肾壁厚5 mm，不但侵犯周围组织，且有远处转移。1.2 方法1.2.1 ELISA MMP2、MMP9 和 VEGF 抗体和酶联免疫吸附法试剂盒购自福建迈新生物科技发展有限公司。液氮罐保存肾癌组织按 2.5 ml/g 质量加入相当体积的冰生理盐水，用匀浆器将组织研磨，然后在冰浴下超声波粉碎制成匀浆，4，10 000 r/min 离心 10 min，取上清液。实验严格按照 MMP2、MMP9 和 V
5、EGF酶联免疫吸附法说明书步骤进行。1.2.2 Western 印迹检测法 用 Western 印迹方法检测肾癌组织MMP2、MMP9、VEGF 含量。按 10 ml/g 的比例加入全细胞裂解液，组织经匀浆、超声破碎后，用二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白定量。10的十二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝脑电泳（SDSPAGE）法上样量为 28 g。电泳条件:4。电流32030 mA。电泳结束后，进行蛋白质转膜。转膜条件：采用孔径为 0.22 m 的硝酸纤维素膜(NC)，4,电流 400 mA，转膜 3 h。Western 印迹杂交步骤如下：10脱脂牛奶封闭 NC 膜 1 h，TYBS(20mmol/L Tr
6、isHCl，pH 7.5；0.15 mmol/L NaCl；0.05Tween 20)漂洗 3 次，每次 10 min，然后室温下与 APP、MBP(11 000)杂交反应 3 h，吐温 20/Tris 盐酸缓冲液（TTBS）漂洗同前。再将 NC 膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(15 000)杂交反应 1 h。最后用 TTBS 漂洗 NC 膜 3 次，每次 10 min，加入 ECL 试剂反应 5 min，保鲜膜包裹，暗室 X光胶片曝光、显影和定影。然后同一张 NC 膜再与 actin(11 000)进行 Western 印迹杂交反应,并获得蛋白印迹结果。Western 印迹条带经 Ge
7、loc 凝胶成像分析系统扫描处理，计算单位吸光度值和条带面积，将各实验点的总吸光度值与对照组比较，得到相对百分数。1.2.3 逆转录聚合酶链反应法（RTPCR） 提取各组肾癌组织总 RNA 并定量,用DNA 酶处理总 RNA 以去除 DNA 污染,各实验组取同等量的 RNA 反转录后进行 PCR。MMP2、MMP9 和 VEGF PCR 引物设计见表 1(北京奥科生物科技有限公司)。将 PCR 扩增的产物 5 l 在 2的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压一般为 7080 V。电泳完毕后，取出凝胶在紫外灯下观察结果并照相。结果用 Quantity One4.4.0 软件行定量分析，以目的基因与 act
8、in 条带平均光密度比值表示目的基因 mRNA 的相对表达量。表 1 MMPs 和 VEGF PCR 引物设计1.3 统计学处理 数据以 xs 表示，采用 SPSS11.0 软件包进行统计学处理，组内不同时相点的比较采用方差分析，组间同一时相点的比较采用 t 检验，Oneway Pearson 线性相关分析。2 结 果42.1 肾癌组织 ELISA 法 MMP2、MMP9 和 VEGF 的水平比较 酶联免疫吸附法检测显示、和期肾癌组织 MMP2/MMP9 和 VEGF 明显表达。与期比较，、和期肾癌组织 MMP2/MMP9 和 VEGF 的水平均有增高(P0.01)，MMP2/MMP9 和 V
9、EGF 在、和期肾癌组织中明显表达，尤其期肾癌组织中表达最明显。见表 2。2.2 MMP2、MMP9 和 VEGF Western 印迹水平比较 蛋白质印迹法检测MMP2/MMP9 和 VEGF 结果与酶联免疫吸附法检测结果具有一致性，MMP2/MMP9 和 VEGF 在、和期肾癌组织中明显表达，尤其期肾癌组织中表达最明显(P0.01)。图 1 和表 3。表 2 ELISA 法 MMP2/MMP9 和VEGF 表达表 3 Western 印迹水平比较 MMP2/MMP9 和 VEGF 的表达2.3 MMP2，9 和 VEGF RTPCR 水平比较 TRPCR 检测大鼠脑组织 mRNA MMP2
10、/MMP9 和 VEGF 的表达水平与蛋白质表达水平结果也具有一致性，MMP2/MMP9 和 VEGF 在、和期肾癌组织中明显表达，尤其期肾癌组织中表达最明显(P0.01)。图 2 和表 4。表 4 mRNA 水平比较MMP2/MMP9 和 VEGF 的表达 3 讨 论ECM 是肿瘤转移的主要屏障。MMPs 是降解 ECM 最重要的酶类。MMPs 活性上调与肿瘤侵袭、转移有关。金属蛋白酶组织抑制剂 TIMPs 作为 MMPs 的天然抑制物，可下调 MMPs 活性，对维持 ECM 具有重要作用。活化的 MMPs 与 TIMPs 的平衡关系受到破坏，提示有肿瘤侵袭和转移的可能性。基质金属蛋白酶是一
11、个依赖锌离子的肽链内切酶基因家族，目前已发现 17 种，几乎可以降解 ECM 的所有5成分。MMP9 也称明胶酶或型胶原酶，分子量为 92 kD。MMP9 可降解、V 型胶原、明胶等多种底物，而 IV 型胶原构成基膜的主要支架。因此其在肿瘤发生发展及侵袭过程中起着非常重要的作用。MMPs 在肿瘤组织中的表达和分布报道不一。大多数研究认为，明胶酶、间质溶素主要表达于间质细胞，基质溶素(MMP7)是由肿瘤细胞分泌的5，6，肿瘤细胞和间质细胞可通过多种机制相互作用而影响 MMPs 与 TIMPs 的表达和分布。生长因子及细胞因子以旁分泌或自分泌的方式影响 MMPs 的表达，而 MMPs 与 TIMP
12、s 可调节肿瘤侵袭处的细胞因子、生长因子的活性及分布。肿瘤细胞表达的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子能诱导成纤维细胞表达 MMP1、MMP2 和 MMP37，8。本研究显示肾癌组织 MMP2、MMP9 的表达水平显著增高，且 MMP2、MMP9 的表达与肾癌的临床分期密切相关，且有局部浸润和转移的肾癌 MMP2、MMP9 表达水平明显高于无局部浸润转移的肾癌9，10。也有研究认为，MMPs 的表达状况与TIMPs 的活性调节密切相关，恶性肿瘤组织 MMPs 的表达受 TIMPs 表达调控，单一 MMPs 表达水平的高低并不能预测恶性程度和评估预后，需同时检测 TIMPs的表达。因此，MMP2、MM
13、P9 的表达能否准确评价恶性肿瘤病人的预后，尚有待于进一步研究。VEGF 是一种增加血管通透性并促进新血管生长，是血管通透性因子中作用最强、特异性最高的因子之一。VEGF 在许多恶性肿瘤呈高表达并与侵袭转移和预后等生物学行为关系密切，可能与肿瘤及肿瘤转移灶的生长中的血管生成有关。已有研究表明，在许多人类肿瘤中有 VEGF 的表达，肿瘤细胞可以通过表达VEGF 诱导淋巴管生成，促进肿瘤细胞淋巴转移11。本实验对不同临床分期的肾癌患者肾癌组织检测均发现 VEGF 表达，随着病程的进展 VEGF 活性逐渐增高，6以期晚期最明显，且 VEGF 表达与病情的恶化具有一致性，进一步证实了VEGF 参与了肾
14、癌的发病机制，而且 VEGF 随着病程进展表达增强。这一结果与MMP2、MMP9 也参与了肾癌的演进具有一致性，而且 VEGF 与MMP2、MMP9 表达具有正相关性，所以，推测 VEGF 表达与MMP2、MMP9 表达在肾癌发病机制中具有协同作用。也推测利用反义寡核苷酸、siRNA 技术或免疫介导途径使 VEGF 基因沉默，对于表达 VEGF 的肾癌来说，MMP2、MMP9 和 VEGF 或许能成为一个治疗靶点。总之，MMP2、MMP9 和 VEGF 在肾癌临床病情进展具有平行性，临床晚期肾癌 MMP2、MMP9 和 VEGF 表达最高，即一定程度上 MMP2、MMP9 和VEGF 表达的高
15、低可以反映病情的恶化。目前对于 VEGF 参与癌症的研究已有大量报道，对 MMP2、MMP9 的研究刚刚起步，还有许多问题尚未阐明，但相信随着研究的进一步深入，由于其既参与肾癌的发生又参与肾癌的进展，因此MMP2、MMP9 和 VEGF 有望成为肾癌诊断和基因治疗的新靶点，为肾癌的诊断治疗开辟一条新途径。【参考文献】1 Christopoulos TA,Papageorgakopoulou N,Ravazoula P,et al.Expression of metalloproteinases and their tissue inhibitors in squamous cell laryn
16、geal carcinomaJ.Oncol Rep，2007；18(4):85560.2 Gao ZL,Zhang C,Du GY,et al.Clinical significance of changes in tumor markers,extracellular matrix,MMP9 and VEGF in patients with gastric carcinomaJ.Hepatogastroenterology，2007；54(77):15915.3 Nomiya T,Nemoto K,Nakata E,et al.Expression of thymidine phosphorylase and V
