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1、1siRNA 设计研究进展及在线设计作者：樊鹏程, 贾正平, 马骏, 王荣【关键词】 siRNA 设计 基因沉默 RNA 干涉 序列分析研究基因功能的方法之一是减少或消除其在细胞中的表达。RNA 干扰 (RNA interference, RNAi) 技术可以研究一个单独基因的作用, 其效应因子为小干扰RNA(small interfering RNAs, siRNA)分子1。并非所有针对某基因不同位置碱基所设计的 21 个碱基 siRNA 都有相似基因沉默效率, 针对同一 mRNA 内不同位置随机设计的 siRNA 表现明显不同活性2。siRNA 沉默效率主要取决于 21 个碱基序列的合理设
2、计, 如何设计针对目的基因的高效特异性 siRNA 是基因沉默的关键。使用生物信息学、 计算机辅助手段选择最佳 siRNA 正成为研究的热点3, 4。1 siRNA 设计规则研究借助生物信息学手段以选择最佳 siRNA, 可使用一些筛选模型优化寡核苷酸序列性质, 诸如 G/C 比例, 碱基变化以及序列中重复碱基数目。1.1 siRNA 反义链 5末端碱基设计 RNA 诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC)形成的起始过程为一个解旋酶介导的 siRNA 末端解链过程。siRNA 中一末端碱基配对越松散, 该末端越易被 RISC 解开。预测高效 si
3、RNA存在较松散的 5反义末端5, 可在 siRNA 反义链同 RISC 结合时引导其识别目的 mRNA 序列。若 siRNA 正义链 5末端为松散碱基配对, 则可能导致非目的基因的沉默。21.2 siRNA 正义链设计 为确定 siRNA 的特异性, Reynolds 等系统地测定了针对萤火虫荧光素酶和人胞溶质蛋白 B 基因各 197 个碱基区域分别设计的各 90 个siRNA 的沉默效率2。结果显示高效 siRNA 至少有超过 3 个 A/U 在 15 和 19 之间(正链末端的第 1 个碱基定义为位置 1); A/U 在 19 位, 该规则反映 siRNA 同自然发生的 miRNA 过程
4、相类似; 正义链位置 3 存在一个 A, 该结果支持 miRNA同 siRNA 过程存在相似的蛋白机制的假说; A/U 在 10 位, 提示激活的 RISC 可能是在距离 5末端 10 到 11 个碱基位置针对 mRNA 发生作用。正义链 19 位不为 G或 C; 正义链 13 位不为 G。1.3 G/C 比例 复含 G/C 的序列较富含 A/T 的序列更易形成稳定的双链, 因此在一个序列中不应同时存在超过 7 个 G/C 配对, 且同一序列中 4 个或更多的 G因为易形成交连复合体而应被排除。测定 dsRNA 两末端的自由能及稳定性, 结果表明依 19 个碱基设计的 siRNA, 其 G/C
5、 配对比例不宜超过 36.8%5。1.4 siRNA 目的位置二级结构预测提高 siRNA 效率 siRNA 双链末端不同热力学稳定性, 提示哪条链会进入 RISC 中。Heale 等应用双链末端稳定性计算方法研究二级结构在 siRNA 设计中的作用, 发现双链末端稳定性对于沉默效果预测影响占 60%, 二级结构预测可改善 siRNA 位点预测效率, 80%的非作用位点可以通过二级结构预测来排除。1.5 内部重复序列 因包含内部重复序列或回文序列的 siRNA 可能形成潜在内部发卡结构或折叠结构, 降低了 siRNA 有效浓度及沉默效力, 故 siRNA 设计时应避免内部重复序列。2 通过非目
6、的位点错配寻找高效 siRNA3优化 siRNA 序列来实现同非目的基因的最小错配, 以最小化非目基因沉默。siRNA 序列较短, 按照同非目的位点最少存在 3 个以上的错配, 一般有 4 至 5 个相邻的序列符合条件。故 BLAST 搜寻经常忽略了非目的候选物, 而现有的准确搜寻方法执行时间太长。Yamada 等6开发的高效 siRNA 算法, 能准确快速地列出对于任意人类基因 siRNA 序列的潜在杂交位点, 优于传统计算方法。3 高活性 siRNA 筛选算法、 模型研究3.1 自组装图形技术 Takasaki 等7将自组装图形技术和统计显著性差异分析用于筛选高活性 siRNA 序列, 使
7、用评分作为基因沉默效率的衡量。分析了针对 12个基因中的 172 个 siRNA 序列, 并同其他已报道的评分方法做了比较, 结果其评分同基因沉默水平明显相关。3.2 热力学及结构特征优化神经网络模型的建立 建立可信的 siRNA 模型对于功能基因组研究十分必要, 通过分析 siRNA 热力学参数及相关性分析, 优化得到的神经网络模型能够有效预测不同浓度 siRNA 沉默效率8。该模型仅需较少siRNA 序列参数即可预测 siRNA 沉默效率, 减少了计算量。4 siRNA 在线设计Amhion, Dharmacon, Qiagen 等公司网站及 Whitehead siRNA Selecti
8、on Web Server, siDirect 和 DEQOR 等在线软件支持 siRNA 设计。Whitehead siRNA 设计服务器集成已公布的设计规则, 为使用者提供 21 个碱基 siRNA 信息, 双链 RNA热力学稳定性, G/C 含量, 及其他可能对 siRNA 干涉效果产生影响的特征参数。OptiRNAi 软件工具, 通过植入的 Blast 搜索引擎来优化 siRNA 结合目标序列的4特异, 是一款高效、 界面友好的 RNAi 搜索工具9。siDirect 在线 siRNA 设计系统, 用于计算高效且对于哺乳动物细胞有着最大特异性的 siRNA 序列。通过列举出 BLAST
9、 搜索可能忽略的潜在的杂交候选物, 避免对非目的基因的沉默。支持以任意碱基序列作为搜索项输入, 并很快返回候选 siRNA, 提供较广泛的哺乳动物 RNAi 应用, 包括功能基因及治疗相关基因的沉默。其网址为 http: /design.RNAi.jp/。BLOCK iTTM RNAi Designer 使用专利算法允许 RNAi Designer 选择独特靶序列, 明显提高目的基因沉默效率, 其网址为: 是 Chalk 等开发的一款 siRNA 设计软件, 目前的版本为 1.7。该软件通过分析针对 92 个基因的、 有效的 siRNA 398 条, 应用氢键的能量分布规律进行设计。其界面友
10、好, 可将序列通过在线服务器直接提交进行设计: http: /sisearch.cgb.ki.se/。Matveeva 等10通过相关性分析, 对双链稳定性, 核苷酸位置依赖活性, 总 G/C 比例作为输入参数, 进行线性回归, 根据回归结果设计了 siRNA scale 程序。并比较了 siRNA scale 同 BioPredsi, ThermoComposition, DSIR3 个程序的 siRNA 预测效率。siRNA scale 预测 siRNA 同 BioPredsi 接近, 优于其他程序。目前多数基于网络的 siRNA 设计程序需要单独输入每个序列, 使大型批量分析难以实现,
11、且非目标位置的搜寻也受到限制。Batch RNAi selector 通过执行 WU BLAST, FASTA, SSEARCH 同源搜索程序来改善 siRNA 筛选的特异性, 并确定可能导致非目的基因沈默的 siRNA 候选序列, 同时引入了 siRNA 评分及 siRNA 内部稳定性计算结果, 该程序可免费下载,运行平台为 Linux11。Support vector machines 使用限制性优化筛选模型, 利用已公布的 2200 个 siRNA中被预测的最为有效的 572 个序列, 包括其热力学性质、 同目的 mRNA 序列的可接近程度及自身发卡结构性质12。该工具可改善 90%的活
12、性 siRNA 位点预测, 5网址为 http:/optirna.unl.edu/。法国枫丹白露生物计算中心服务器结合 siRNA 序列基本性质来预测 siRNA 效率, 并通过大型 siRNA 序列数据库训练和测试, 能直接提供相关生物学性质, 网址为 http:/cbio.ensmp.fr/dsir。siRNA Scan 程序能够识别可能沉默非目的基因的 siRNA 序列, 并通过定量反转录 PCR 实验验证, 结果显示其预测非目的基因沈默的准确率接近 50%。故该程序能够帮助筛选更好的转录后基因沉默的 siRNA 结构13。siRNArules 为奥斯陆大学分子神经生物研究中心开发的一个
13、 siRNA 沉默效率预测软件, JAVA 语言编写, 源代码开放, 其访问网址为 http: / 为一款抗病毒 siRNA 设计软件, 主要针对高分叉病毒高度保守序列设计。其设计目标为同病毒结构活性相关的保守区域, 故可能对高度变异病毒亦有效。其对于 HIV 和 HCV 及 SARS 等病毒的 siRNA 筛选均验证有效, 网址为 http: /siVirus.RNAi.jp/。siRNAs 为明尼苏达大学神经科学学院建立的经实验验证有效的哺乳动物 siRNA 数据库, 可为研究者研究开发可信的 siRNA 设计规则提供支持14。目前该数据库提供了来自 1200 个研究的超过 4100 个详
14、细注释的 siRNA 序列, 其访问网址为 http: /siRecords.umn.edu/siRecords/。 5 结语siRNA 序列的设计优劣将直接影响 RNAi 效果, 合理设计的 siRNA 序列能够提高基因沉默的效率。siRNA 所含碱基序列、 dsRNA 双链末端的稳定性、 目的mRNA 上相应序列的二级结构及 siRNA 同 RISC 的结合均同 RNAi 过程有关。通过生物信息学、 计算机辅助手段来优化 siRNA 设计以提高 RNAi 效率成为行之有效的手段。有人提出设计针对每个人类基因的 siRNA 文库, 以找到基因治疗中的新靶点15。siRecords 数据库即为
15、已建立的 siRNA 数据库之一, 其中包含了经实验验证的针对 1518 个基因而设计的 3277 条 siRNA 记录16。目前的研究多集6中在不同角度、 不同方向的 siRNA 设计研究, 数据库样本尚不够大。针对已有实验数据的高效 siRNA 序列信息而建立的综合数据库将成为 siRNA 设计的有效解决方法。【参考文献】1 Dykxhoorn DM, Novina CD, Sharp PA. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expressionJ. Nat Rev Mol Cell Biol, 2003, 4(6):
16、 457-467.2 Reynolds A, Leake D, Boese Q, et al. Rational siRNA design for RNA interferenceJ. Nat Biotechnol, 2004, 22(3): 326-330.3 陈 凌, 郑祥雄. CD40 发夹 siRNA 真核表达载体构建及其对 CA46 细胞CD40 表达的影响J. 细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21(2): 163-166.4 陈杰斌, 许从峰, 虞 勇, 等. CVB3 VP1 siRNA 对 CVB3 复制的抑制作用J. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(3): 306-309.5 Gong D, Ferrell JE. Picking a winner: new echanistic insights into the
