《三氧化二砷对人胃癌裸鼠移植瘤血管生成素2和血管内皮生长因子表达的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《三氧化二砷对人胃癌裸鼠移植瘤血管生成素2和血管内皮生长因子表达的影响（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1三氧化二砷对人胃癌裸鼠移植瘤血管生 成素2 和血管内皮生长因子表达的影 响作者：肖延风，刘陕西，邬德东，陈玺，任利芬【摘要】 目的 研究三氧化二砷(As2O3)对肿瘤血管生成素 2(Ang 2)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法 用人胃腺癌细胞株 SGC7901 接种 30 只裸鼠皮下，建立实体瘤模型；然后随机分为 As2O3 高剂量(5mg/kg)、低剂量(2.5mg/kg)治疗组和对照组，每组各 10 只。治疗组接受 As2O3 腹腔注射 10d，对照组注射生理盐水。测量肿瘤体积并计算抑瘤率；免疫荧光标记 CD31 并计算血管密度；免疫组化方法测定 Ang 2 的表达；免疫荧
2、光激光共聚焦检测 VEGF 的表达。结果 砷剂治疗可抑制瘤块生长，2.5mg/kg 和 5mg/kg As2O3 治疗组的抑瘤率分别为 30.33%和50.85%。As2O3 治疗组的微血管密度(MVD)、VEGF 荧光表达水平均显著低于对照组(P0.01)。Ang 2 主要在血管内皮细胞的胞浆中呈强阳性表达，可清晰标记肿瘤内的血管；对照组和 As2O3 治疗组血管内皮细胞 Ang 2 表达强度无明显差异。结论 As2O3 对 Ang 2 表达无明显影响，在 As2O3 治疗抑制瘤细胞 VEGF表达的情况下，Ang 2 表达可促进血管的退化。Ang 2 主要在新生的内皮细胞表达，故可能作为新生
3、血管的标记物，成为肿瘤新生血管研究的新指标。 【关键词】 三氧化二砷；血管生成素 2；血管内皮生长因子；血管生成；胃癌；血管密度ABSTRACT: Objective To investigate the effect of arsenic trioxide (As2O3) on expression of angiopoietin 2 and vascular endothelial growth factor (VEGF) in cancer. Methods The solid tumor model was formed in nude mice with gastric cancer
4、 cell line 2SGC 7901. The 30 nude mice were randomly divided into the two arsenic treated groups (2.5mg/kg and 5mg/kg) and control group. As2O3 was injected to mice in the treated groups for 10 days; the same volume of saline solution was injected to the control group. The volume of gastric tumor xe
5、nografts was measured and counted for tumor growth inhibition (TGI). Microvessel density (MVD) labeled by CD31 was measured with immunofluorescence. Expression of angiopoietin 2 was detected by immunohistochemistry, and expression of VEGF was detected by immunofluorescence laser confocal technology.
6、 Results Tumor growth inhibitions were 30.33% and 50.85% in 2.5mg/kg and 5mg/kg As2O3, respectively. Decrease of MVD appeared in As2O3 treated tumors compared with that in the control group. The fluorescence intensity level of VEGF in tumor cells was lower significantly than that in the arsenic trea
7、ted groups. Angiopoietin 2 was mostly expressed in endothelial cells in tumors. There was no difference in expression level of angiopoeitin 2 between arsenic treated groups and the control group. Conclusion As2O3 does not affect the expression of angiopoietin 2. Angiopoietin 2 may induce vessel regr
8、ession, and VEGF expression is decreased by As2O3 in tumor. Angiopoietin 2 may become a new indicator in study on angiogenesis in tumor.KEY WORDS: arsenic trioxide; angiopoietin 2; vascular endothelial growth factor; angiogenesis; gastric cancer; microvessel density有多种细胞因子通过不同的受体参与血管生成过程，其中特异性作用于内皮细
9、胞的细胞因子有两类：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血管生成素(angiopoietin, Ang)。VEGF 促进内皮细胞增殖，而 Ang 则支持细胞的募集。Ang 与 VEGF 协同作用，参与调节新生血管生成。Ang 家族是唯一含受体激动剂及抑制剂的促血管生成因子，目前发现 4 个成员，其中 Ang 1 和Ang 2 已经被证实与肿瘤血管生成关系密切，而 Ang 3 和 Ang 4 与肿瘤血管新生的相关研究较少。目前，研究认为 Ang 1 的表达与肿瘤血管形成的多少关系不大；而 Ang 2 表达是肿瘤血管新生起始及加强的
10、因素，与肿瘤血管形成数目、临床分期及预后关系密切1 2。Ang 2 和 VEGF 对肿瘤血管新生均起重要作用，而 Ang 2 对血管的调节呈 VEGF 依赖性。砷是一种氮族金属元素，以 3 价或 5 价形式广泛存在。砷化物砒霜(主要成分为3As2O3)作为中药使用已有上千年历史，用于肿瘤治疗也有几百年的历史。我国学者首先用 As2O3 治疗急性粒细胞白血病获得显著疗效。近年来，已发现 As2O3 对肿瘤血管生成有抑制作用。本研究建立人胃腺癌裸鼠移植瘤模型，采用 As2O3 腹腔注射治疗，观察瘤组织中 Ang 2 和 VEGF 的表达情况，旨在探讨 As2O3 对肿瘤 Ang 2 和 VEGF
11、表达的影响，以阐明 As2O3 抑制肿瘤血管生成的作用机制。1 材料与方法1.1 动物模型的建立 裸鼠 30 只，雄性，5 周龄，体重 1921g，于第四军医大学实验动物中心 SPF 动物实验室饲养。人胃腺癌株 SGC7901 细胞常规培养至对数生长期(10d)，用 RPMI 1640 调整细胞密度至 2107/mL；取该细胞悬液0.2mL(4106 个 SGC7901 细胞/只)接种于每只裸鼠右后肢背部皮下。1.2 实验分组和药物干预 裸鼠接种 SGC7901 细胞后，隔天观察一次，瘤块变硬，且长径大于 0.5cm 视为成瘤。于接种肿瘤细胞第 10 天，观察每只裸鼠均形成瘤节。于接种肿瘤细胞
12、第 11 天按随机分组的原则将 30 只裸鼠分为 As2O3 低剂量治疗组(2.5mg/kg 组)、高剂量治疗组(5mg/kg 组)和对照组。分别腹腔注射 As2O3 2.5mg/kg、5mg/kg 及生理盐水 0.2mL，每天 1 次、连续给药 10d。1.3 取材及固定 于末次给药次日(即治疗第 11 天)，腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，迅速取下瘤块并称重后放入 40g/L 多聚甲醛溶液中固定，供制备冰冻切片和石蜡切片用。另外，取肝肾组织制备石蜡切片，HE 染色，观察组织形态学变化。1.4 抑瘤率(tumor growth inhibition, TGI)的计算 于治疗开始前、治疗第 6 天
13、、第11 天分别测量瘤块的长径(a)、短径(b)，瘤块体积(mm3)=ab2/2，抑瘤率=(1-治疗组4平均瘤块体积/对照组平均瘤块体积)100%。1.5 血管生成素 2 表达的检测 采用免疫组化法，步骤如下：脱蜡、脱水，取出制备好的石蜡切片在以下液体中浸泡：二甲苯 15min二甲苯 15min无水乙醇10min95%(体积分数)乙醇 10min80%(体积分数)乙醇 10min；纯水浸泡，25min；滴加 H2O2，置湿盒中室温下孵育 10min；纯水冲洗，PBS 浸泡5min；滴加山羊血清，37下孵育 20min，倾去，勿洗；滴加一抗，为兔抗人Ang 2 多克隆抗体(美国 Santa Cr
14、uz 生产)，37条件下孵育 3h；PBS 冲洗，35min；滴加羊抗兔 IgG，37条件下孵育 15min；PBS 冲洗，35min；滴加过氧化酶标记的辣酶卵白素工作液，37条件下孵育 15min；PBS 冲洗，35min；显色剂(DAB)显色 10min；自来水冲洗，浸泡 25min；脱水、透明，将以上玻片分别在以下液体中浸泡：80%(体积分数)乙醇 5min95%(体积分数)乙醇5min无水乙醇 10min无水乙醇 10min二甲苯 10min二甲苯 10min；封片：将中性树胶滴于载玻片上，缓慢放下盖玻片封片。将制作好的玻片置于光镜下，在 400 倍和 1000 倍下观察结果，在血管热
15、点区取图，摄像。1.6 CD31 和 VEGF 表达的检测 采用免疫荧光法，步骤如下：取出已经用40g/L 多聚甲醛固定好的冰冻切片，置于室温下 30min，然后蒸馏水浸泡5min，PBS 浸泡 5min；1g/LTriton X 100 打孔 10min；PBS 冲洗 35min；滴加封闭血清，37条件下孵育 20min，倾去，勿洗；分别滴加稀释的一抗兔抗人 VEGF 多克隆抗体(Labvision, USA)；大鼠抗小鼠 CD31 一抗(Biolegend, USA)4过夜；PBS 冲洗 35min；分别滴加 FITC 标记的绵羊抗兔荧光二抗(Sigma)和TRITC 标记的羊抗大鼠荧光二
16、抗(Sigma)，37条件下反应 1h；PBS 冲洗310min；甘油封片。1.7 激光共聚焦分析 用激光共聚焦显微镜(TCS SP2，德国 Leica)，450500nm5波长激发，515565nm 波长观察结果。在每个肿瘤标本上取 10 个图像，用 LeiCa Confoncal 图片处理软件进行荧光强度分析，取均值表示该标本的荧光强度。1.8 血管计数 在荧光显微镜(德国 ZEISS)下观察结果。能被 CD31 荧光着色且分界清楚、并能与临床血管、肿瘤细胞及其他结缔组织区分的内皮细胞作为单个计数微血管。选择微血管热点区(neovascular hot spot)，光镜 40 倍视野下选择 20 个计数其内微血管数，取平均数即为微血管密度。1.9 统计学处理 使用 SPSS13.0 软件处理数据，计量资料采用均数标准差(s)表示。多样本均数比较采用完全随机设计的单因素方差分析，各组均数间的两两比较用 Student Newman Ke
