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1、1MCI186 减轻 A140 诱导 PC12 细胞 tau 蛋白磷酸化的研究【摘要】 目的 探讨依达拉奉(MCI 186)对 样淀粉蛋白(A1 40)引起的 PC12 细胞 tau 蛋白磷酸化的保护作用及其机制。方法 采用 Western 印迹等检测Ser396，Ser199/202，Tau 5 及 GSK 3，GSK 3Ser9 磷酸化水平,观察MCI 186 对 A25 35 致 PC12 细胞的损伤保护作用。结果 模型组 tau 蛋白在Ser396、Ser199/202 位点的磷酸化水平及总 tau 蛋白水平在 A1 40 作用 3 h 后开始升高，同时 GSK 3 的表达增多，磷酸化
2、 GSK 3Ser9 的表达减少，MCI 186保护组 tau 蛋白在 Ser396，Ser199/202 位点的磷酸化水平和总 tau 蛋白水平均明显低于 A 模型组(P0.05)，GSK 3 的表达减少，磷酸化 GSK 3Ser9 的表达增多(P0.05)。结论 在 A1 40 诱导 PC12 细胞损伤过程中，出现了 tau 蛋白的过度磷酸化，可以使 Ser396，Ser199/202 位点及 Tau 5 蛋白升高。激活 GSK 3是产生 tau 蛋白过度磷酸化的主要途径。MCI 186 可通过抑制 GSK 3 的活性，从而减轻 A1 40 诱导的 tau 蛋白过度磷酸化，而达到保护神经细
3、胞的目的。 【关键词】 依达拉奉;阿尔茨海默病;糖原合成酶激酶 3;tau 蛋白磷酸化AD 是常见的中枢神经系统退行性疾病，在众多的发病机制中，更多的学者倾向于其核心改变是 tau 蛋白过度磷酸化。目前临床上用来治疗 AD 的药物均只能改善轻中度患者的部分症状，不能减轻脑内的病理改变，阻止病情的进展，对 tau 蛋白的过度磷酸化没有逆转作用。依达拉奉(MCI 186)是一种自由基清除剂，可以特异性清除羟自由基( OH)，抑制氧化应激及其继发的细胞凋亡，发挥神经保护作用，主要应用于脑梗死的早期和脑出血的治疗。临床发现依达拉奉对部分痴呆2患者有改善症状的作用，从而提示其可能是一种具有前途的治疗 A
4、D 的药物。本研究旨在探讨依达拉奉对 tau 蛋白过度磷酸化是否有逆转作用。1 材料与方法1.1 药品与试剂 PC12 细胞购自中国生命科学院上海细胞所，A1 40、兔抗鼠 IgG 购自北京鼎国生物公司，TauPS396多克隆抗体、TauPS199/202多克隆抗体购自 Biosource 公司，Tau 5 单克隆抗体购自 BD Pharmingen 公司，Protein Marker 购自美国 Biolabs 公司，DAB 显色试剂盒购自博士德公司,依达拉奉购自江苏先声药业有限公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养和预处理 用含有 15%胎牛血清的 DMEM 培养基(3.7 g NaHCO3
5、)，置于 37，5% CO2 孵箱中培养，每 3 天传代 1 次，传代时用机械方法吹打贴壁的 PC12 细胞，取生长期细胞用于实验。1.2.2 实验分组1.2.2.1 A1 40 诱导分化 PC12 细胞 tau 蛋白磷酸化 将 30 mol/L A1 40 作用于 PC12 细胞，分别作用 0，3，6，12，24，36 h 后提取蛋白检测 TauPS396、TauPS199/202及 Tau 5 磷酸化水平。1.2.2.2 LiCl 对 A1 40 诱导分化 PC12 细胞 tau 蛋白磷酸化的影响 实验分为3 组：(1)对照组：正常 PC12 细胞;(2)模型组：加入浓度为 30 mol/
6、L A1 40 作用于 PC12 细胞 12 h;(3)LiCl 处理组：加入浓度为 10 mmol/L LiCl 与 30 mol/L A1 40 共同作用于 PC12 细胞 12 h;检测 TauPS396，TauPS199/202，Tau 53及 GSK 3，GSK 3Ser9 磷酸化水平。1.2.2.3 MCI 186 对 A1 40 诱导分化 PC12 细胞 tau 蛋白过度磷酸化的影响 分 3 组：(1)对照组：不加任何处理因素;(2)模型组：加入浓度为 30 mol/L A25 35作用于 PC12 细胞 12 h;(3)保护组：将 20 mol/L MCI 186 处理 PC1
7、2 细胞 2 h 后与 30 mol/L A1 40 共同作用于 PC12 细胞 12 h;分别检测 TauPS396、TauPS199/202、tau 5 及 GSK 3，GSK 3ser9 磷酸化水平。1.2.3 蛋白免疫印迹法(Western 印迹法) 常规蛋白质提取; 采用 Bradford(1976)法进行蛋白质定量。一抗为 TauPS396多克隆抗体、TauPS199/202多克隆抗体、Tau 5 单克隆抗体、GSK 3、GSK 3ser9 抗体，二抗为兔抗鼠 IgG。1.3 统计学分析 所有数据均采用 xs 表示，采用 SPSS13.0 统计软件完成，并用 EXCEL 软件制图。
8、2 结 果2.1 A1 40 诱导 PC12 细胞 tau 蛋白磷酸化水平的变化 tau 蛋白在Ser396、Ser199/202 位点的磷酸化水平在 A1 40 作用 3 h 后开始升高，达高峰12 h 后逐渐降低;Tau 5 是磷酸化非依赖性抗体，反映细胞中 tau 蛋白的总量，其变化趋势与 tau 蛋白在 Ser396、Ser199/202 位点的磷酸化增高相一致，提示A25 35 在诱导 PC12 细胞致 tau 蛋白磷酸化增高的同时，也增加 tau 蛋白总量，见图 1。2.2 A1 40 诱导 PC12 细胞 tau 蛋白过度磷酸化分子机制2.2.1 LiCl 对 A1 40 诱导分
9、化 PC12 细胞 tau 蛋白磷酸化的影响 凝聚态4A1 40 作用于 PC12 细胞 12 h 后，Tau 蛋白在 Ser396、Ser199/202 位点的磷酸化水平增高;Tau 5 蛋白的表达也相应增高，提示凝聚态 A1 40 可诱导 PC12 细胞 tau 蛋白过度磷酸化。LiCl 处理组 tau 蛋白在上述位点的磷酸化水平与单纯 A处理组相比明显下降，总 tau 蛋白的表达也减少，提示 LiCl 可抑制 A 所诱导的tau 蛋白过度磷酸化，见图 2。2.2.2 LiCl 及 A1 40 对 PC12 细胞中 GSK 3 及磷酸化 GSK 3Ser9 的影响 A1 40 作用于 PC
10、12 细胞 12 h 后，细胞内 GSK 3 明显高于对照组，GSK 3Ser9 则低于对照组。可见 A1 40 在诱导 PC12 细胞神经元 tau 蛋白过度磷酸化的同时 GSK 3 的表达增多，而磷酸化 GSK 3Ser9 的表达减少，说明A1 40 可通过激活 GSK 3 而使 tau 蛋白磷酸化增多。而 LiCl 处理组磷酸化GSK 3Ser9 的表达明显高于模型组和对照组;GSK 3 的表达则低于模型组。结果提示 LiCl 可通过抑制的 GSK 3 活性而使 tau 蛋白磷酸化减少，见图 3。2.3 MCI 186 对 A1 40 诱导分化 PC12 细胞 tau 蛋白过度磷酸化的影
11、响2.3.1 MCI 186 对 A1 40 诱导分化 PC12 细胞 tau 蛋白磷酸化的影响 用 20 mol/L MCI 186 处理后，tau 蛋白在 TauPS396，TauPS199/202位点的磷酸化水平和总 tau 蛋白比模型组减少，见图 4。2.3.2 MCI 186 对 GSK 3 总量及磷酸化 GSK 3Ser9 的影响 MCI 186 减少了 GSK 3 总量的表达，而增加了 GSK 3Ser9 的表达，说明 MCI 186 对 tau蛋白磷酸化的作用机制主要是通过激活 GSK 3，抑制其生物活性实现的,见图5。 3 讨 论5AD 是老年人最常见的神经变性疾病。其主要的
12、分子生化改变为细胞外间隙大量的 A 沉积和神经元胞体内 tau 蛋白的过度磷酸化，两者在病理形态学上分别表现为老年斑和神经原纤维缠结。尽管不少研究对 tau 蛋白与 A 沉积的相互作用进行了探索，然而至今尚无一个得到公认的定论。A 沉积和 tau 蛋白磷酸化之间有密切的联系。Igbal 等1在 1986 年首次报道异常磷酸化的蛋白是患者脑神经元中双螺旋细丝，A 可直接引起 tau 蛋白过度磷酸化与 NFTs 的形成，最终导致神经元退行性改变。吴琪等2在大鼠海马内注射线丝状 A，观察神经元 Ser202 位点磷酸化的 tau 蛋白表达的变化，发现 A42 具有诱导 tau 蛋白过度磷酸化的效应。
13、体外研究也证实凝聚态的 A1 40、A1 42或其活性片段 A25 35 能使原代培养的海马神经元、小脑颗粒神经元、畸胎瘤AD 杂交细胞株 NT2 及 PC12 细胞发生退行性改变，同时导致 tau 蛋白在特定位点的磷酸化增多35。因此，用 A 的生物活性片段 A1 40 诱导建立 tau 蛋白过度磷酸化的细胞模型具有理论和实验依据。Tau 蛋白是一种微管相关蛋白，主要分布于神经元轴突和胞浆内，具有促进管蛋白聚集成微管和维持微管结构的功能。目前发现，Tau 蛋白至少存在近 30 个Ser 或 Thr 磷酸化位点6。已有研究通过对脑组织中不同种类的 tau 蛋白磷酸化状态进行比较，结果发现胎脑中
14、 Ser202、Ser396 和 Ser404 位点有磷酸化形成，在成年人脑中除 Ser404 位点外,其余两位点不再有磷酸化形成;而 AD 患者脑中，Ser202、Ser396、Ser404 以及 Thr181、Thr23、Ser235、Ser262 等位点上均可发生磷酸化。在 PC12 细胞中，可出现部分上述位点的磷酸化79。所以，本实验选用Ser396、Ser202 位点研究 tau 蛋白磷酸化情况。本研究发现该浓度的 A1 40 可6使 PC12 细胞中 tau 蛋白的特定位点(Ser396、Ser199/202)的磷酸化水平增高，且tau 蛋白过度磷酸化与 A1 40 作用持续的时间
15、有关，并具有一定程度的可逆性。A25 35 作用 3 h，Tau 蛋白磷酸化水平开始升高，12 h 达高峰，以后逐渐下降。总 tau 蛋白的变化趋势与 tau 蛋白磷酸化的改变大体一致，可能与 tau 蛋白磷酸化后其降解减少有关，但也有可能与 tau 蛋白功能异常后，细胞代偿合成增加有关。因此，本文选用 12 h 这一 tau 蛋白磷酸化达高峰的时间点，探讨 A1 40 引起 tau蛋白过度磷酸化的可能机制及 MCI 186 的影响。tau 蛋白磷酸化的状态取决于蛋白激酶(催化磷酸化反应)和蛋白磷酸酯酶(催化去磷酸化反应)的相对活性。在蛋白激酶中，GSK 3 最引人注目，在脑内表达丰富，尤其是
16、大脑灰质。在细胞内，GSK 3 主要位于胞浆，在胞核和线粒体中也有少量存在，当撤血清、抑制 PI 3 K 通路、A、神经酞胺、线粒体毒素诱导皮层神经元、小脑颗粒神经元和 PCl2 细胞凋亡时，细胞核内的 GSK 3 明显升高10,11。有研究表明，GSK 3 可能参与 AD 胆碱系统失调过程，最终导致乙酰胆碱合成下降。GSK 3 能使 tau 蛋白 Ser396、Ser199、Thr231、Ser396、Ser413 等位点发生磷酸化10，12，13。GSK 3 的活性受丝氨酸和酪氨酸磷酸化的调节，丝氨酸 Ser9 位点的磷酸化则下调 GSK 3 的活性。所以，本研究用 GSK 3 总量及活化型 GSK 3Ser9 的表达水平反映 GSK 3 的活性变化，探讨 A1 40 是否通过激活 GSK 3 来诱导
