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1、1ApoE 基因多态性、hsCRP 与冠心病的 相关性研究【摘要】 目的 分析载脂蛋白 E（ApoE）的基因多态性、高敏 C 反应蛋白（hs CRP）含量与冠心病的相关性。方法 采用酚氯仿抽提核酸法从凝血块中分离,应用聚合酶链反应（PCR），Hha1 内切酶消化法对 94 例冠心病患者和 100 例健康对照组进行 ApoE 基因多态性进行检测；采用生化全自动仪，以乳胶增强免疫透射比浊法检测血清 hs CRP 含量。结果 ApoE 等位基因频率：冠心病组与对照组比较，2 等位基因频率明显降低（P0.01），4 等位基因频率升高（P0.005）；血清 hs CRP 浓度，冠心病组显著升高（P0.0
2、5），但不同等位基因之间，hs CRP无显著性差别（P0.05）。结论 联合监测 ApoE 基因多态性及血清 hs CRP 含量，对心血管疾病危险性的预测是敏感及有价值的指标。 【关键词】 载脂蛋白 E；基因多态性；高敏 C 反应蛋白；冠心病【Abstract】 Objective To analyze the polymorphism of apolipoprotein E (ApoE), and high sensitivity C reactive protein (hs CRP) levels and the relevance of coronary heart disease (C
3、HD). Methods Phenol chloroform extraction was used to get the DNA from the isolated blocks blood coagulation. Polymerase chain reaction, Hhal endonuclease digestion were used to test the 94 cases of CHD patients and 100 healthy control group ApoE polymorphism. Hs CRP level was measured by immune lat
4、ex transmission turbidity. Results ApoE allele frequency: compared with the control group, 2 allele frequency decreased significantly (P=0.01) in CHD group, 4 allele frequency increased (P=0.005). Serum hs CRP concentration in CHD group was significantly higher than that of control grooup (P0.05), b
5、ut there was no significant difference between different alleles on hs CRP. Conclusions The ApoE gene polymorphism and serum hs CRP are the sensitive and valuable indicators, which can predict the the risk of cardiovascular disease. 【Key words】 Apolipoprotein E; Genetic polymorphism; High sensitivit
6、y 2C reactive protein; Coronary heart disease冠心病(CHD)是常见的多发病,是心血管系统疾病常见的死亡原因之一。研究认为，载脂蛋白 E（ApoE）基因多态性与 CHD 有一定的相关性13，冠状动脉粥样硬化并不是一种简单的脂质沉积疾病,炎症是其重要特征,因此,CHD 是一种炎性疾病。高敏 C 反应蛋白(hs CRP)与 CHD 的关系逐渐被临床广泛关注。本文对94 例 CHD 患者血液进行 AopE 基因多态性及 hs CRP 浓度检测，旨在研究血清hs CRP、ApoE 基因多态性与 CHD 的相关性。1 对象与方法1.1 研究对象 CHD 组 9
7、4 例，其中壮族 42 例，汉族 52 例，均为右江民族医学院附属医院心内科 2007 年 1 月至 2007 年 8 月住院 CHD 患者；男 59 例，女 35 例，年龄 4477 岁，平均（6012.7）岁，全部符合 1979 年世界卫生组织修订的 CHD诊断标准。对照组 100 例，均为同期住院的非 CHD 患者，并排除心脑血管疾病及肝、肾、内分泌等影响脂质代谢的疾病；男 56 例，女 44 例，年龄 4580 岁，平均（6510.8）岁。所有受试者在实验前均知情同意自愿参加本实验。1.2 方法1.2.1 ApoE 基因多态性的检测1.2.1.1 DNA 提取 采空腹静脉血 2.53.
8、0 ml，EDTA 抗凝，用低渗溶血酚 氯仿抽提白细胞核酸 DNA，双蒸水溶解后作为模板。1.2.1.2 聚合酶链反应（PCR）扩增 引物设计参考文献4：引物序列，上游引物P1 为： 5 AAC AAC TGA CCC CGG TGG CG 3,下游引物 P2 为：5 ATG GCG 3CTG AGG CCG CGC TC 3,由深圳匹基公司合成。PCR 反应体系包括10dNTP(各 10 mmol/L)1.0 l,引物 P1 和 P2 各 0.8 l，二甲基亚砜 5 l，DNA 模板 1.0 l，Tag DNA 聚合酶 2 U，加双蒸水至 40 l，混匀即可。PCR 反应条件：95预变性 2
9、 min，然后 95 60 s，56 30 s，72 30 s,共 35 个循环。用 20 g/L 琼脂糖凝胶电泳确定特异性扩增产物(292 bp 片段)。PCR 产物的酶切反应:酶切反应体系包括扩增产物 10 U,10Buffer 5 l,限制性内切酶 Hha1 10 U,加双蒸水至总体积 40 l,置于 37温育 3 h。1.2.1.3 ApoE 基因分型 酶切产物经 100 g/L 聚丙酰胺凝胶电泳,EB 染色后紫外线灯下观察,以 pBR322DNA/Hae 为分子标志物,判断标准参照文献5方法。1.2.2 hs CRP 检测 采空腹静脉血 1.0 ml，分离血清，采用日立 7060 生
10、化全自动仪，以乳胶增强免疫透射比浊法检测。1.3 统计学分析 选用 SPSS10.0 软件进行 t 检验。2 结果2.1 ApoE 的基因型和等位基因频率比较及其多肽性与血清 hs CRP 含量关系 见表 1，表 2。与对照组比较，CHD 组和 2 等位基因频率明显降低(P0.01)，4等位基因频率明显升高(P0.05)。CHD 组 hs CRP 明显高于对照组，而各等位基因组间无显著差异。表 1 ApoE 基因型和等位基因频率比较（略）与对照组比较：1）P0.01；2）P0.0542.2 ApoE 的基因型测定 PCR 扩增产物经 Hha1 酶切后，显示有不同的片段长度组合，可以进行 Apo
11、E 基因型测定，即 PCR RFLP 分析方法。PCR 扩增产物位于 ApoE 基因第 4 外显子内，涵盖 2 个突变位点6，产物长度为 227 bp。纯合子E2/2 在 91，81 bp 出现荧光条带；E3/3 在 91，48 bp 出现荧光条带；E4/4 在 72，48 bp 出现荧光条带；杂合子 E4/2 在 91，81，72，48 bp 出现荧光条带；E3/2 在91，81，48 bp 出现荧光条带；E4/3 在 91，72，48 bp 出现荧光条带。见图 1。 1:E3/3,2：E2/3,3：E2/4,4：E2/2,5：E3/4,6：E4/4；M：Marker图 1 CHD 患者 A
12、po不同基因型电泳图（略）表 2 ApoE 等位基因多态性与血清 hs CRP 含量关系（略）与对照组对应等位基因比较：1）P0.053 讨论ApoE 基因有 3 个等位基因，即 2，3 和 4，共构成 6 种不同的基因型：3 种纯合型（2/2，3/3，4/4）和 3 种杂合型（3/4，2/3，2/4）。ApoE4 是脂质代谢紊乱和 CHD 的重要遗传标记。大多数学者认为，ApoE 4 是早发性 CHD 发病的独立危险因素7，CHD 患者与对照组人群比较 2 等位基因频率明显降低(P0.05),说明 ApoE 基因多态性(2 等位基因缺失)为 CHD 的危险因子之一,亦即 2 与 CHD 成负
13、相关，换而言之，2 等位基因是 CHD 的保护因子8。本研究显示，CHD 患者 ApoE 基因型中，E2/2 和 E2/3 显明性低，而 E4/4 则显著升高(P0.05)；而等位基因频率中，2 明显降低，4 等位基因频率明显高于对照组(P0.05)，与报道相一致9，10。表明 2 等位基因是 CHD 的保护因子，4 等位5基因是动脉硬化发生的潜在因素，4 等位基因频率上升是 CHD 的重要标志。hs CRP 作为一项心血管病变和 CHD 发生独立的危险度预测因子， 已受到临床越来越多的重视，hs CRP 是由肝细胞产生的一种炎症和组织损伤急性期反应的非常敏感的标志物,动脉硬化是一系列病因所致
14、炎症反应引发炎性细胞和介质造成动脉壁损坏所引起。hs CRP 可诱导单核细胞表达组织因子,激活凝血系统和补体系统导致机体凝血、纤溶机制失衡,从而增加心血管事件的危险11。报道证实,hs CRP 高浓度的患者将来发生心肌梗死或心脏致死的危险性超过正常人的 3 倍12。 联合监测 ApoE 基因频率和血清 hs CRP 浓度是目前进行 CHD 危险评估的最佳型13。本研究发现，对照组及 CHD 组 ApoE 各等位基因（2、3 和4）之间的 hs CRP 含量没有明显差异，说明 ApoE 基因多态性与 hs CRP 含量没有直接关联，但两者均与 CHD 有直接关联。因此,联合监测 ApoE 基因多
15、态性及血清 hs CRP 含量，对心血管疾病危险性的预测是一个具有新意和敏感的指标。【参考文献】1 Benes P，Muzik J，Benedik J,et al.Single effects of apolipoprotein B，(a)，and E polymorphisms and interaction between plasminogen activator inhibitor 1 and apolipoprotein(a) genotypes and the risk of coronary artery disease in Czech male caucasiansJ.Mol
16、 Genet Metab，2000;69(2):137 43.2 Wu JH，Lo SK，Wen MS,et al.Characterization of apolipoprotein E genetic variations in Taiwanese：association with coronary heart disease and plasma lipid levelsJ.Hum Biol，2002;74(1):25 31.3 Song Y，Stampfer MJ，Liu S.Meta analysis：apolipoprotein E genotypes and risk for coronary heart diseaseJ.Ann Intern Med，2004;141(2):137 47.4 张典文，付雪茜，高述珍.载脂蛋白
