《Cajal间质细胞在先天性巨结肠分布的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Cajal间质细胞在先天性巨结肠分布的研究（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1Cajal 间质细胞在先天性巨结肠分布的 研究作者：高颖 曲政 王磊 陈新国 古立暖 王加勇【摘要】 目的：通过观察 cajal 间质细胞（interstitial cells of cajal，ICC）在正常结肠及先天性巨结肠先天性巨结肠（hirschsprungs disease，HD）患者痉挛段、移行段、扩张段的分布，探讨 HD 的发病机制。方法:收集 25 例 HD 患儿标本，于术中分别选取扩张段、移行段、痉挛段肠壁的全层组织，另取 6 例手术患儿的正常结肠全层组织标本，常规固定石蜡包埋组织切片备用。对标本行 c-Kit 免疫组织化学染色。光镜观察 ICC 的分布，计数并进行统计学分
2、析。结果:正常结肠 ICC 主要分布在环肌内侧面与黏膜下层之间即黏膜下 ICC（submucosal ICC,ICC-SM）、环肌与纵肌之间的肌间神经从周围即肌间 ICC（myenteric ICC，ICC-MY）以及环肌与纵肌内。HD 患儿痉挛段 ICC-SM、ICC-IM 细胞数较扩张段和正常对照组明显减少(P0.01)，且 ICC 的细胞突起的分支亦减少，彼此之间不能形成完整的细胞网络。而扩张段 ICC 与正常对照组比较无明显差异(P0.05)。结论:HD 患儿结肠 ICC 的异常分布，可能是 HD 发病、肠管蠕动障碍以及排便异常的原因之一。 【关键词】 先天性巨结肠Cajal 间质细胞
3、免疫组织化学【ABSTRACT】 Objective：To investigate the role of interstitial cells of cajal （ICC） in the pathogenesis of HD through observing the distribution of the cells in normal colon and HDs different segments. Methods: The aganglionic、transitional and dilated segments were collected in operations from 2
4、5 children with Hirschsprungs disease. Another 6 normal segmengts were also collected. Each sections was stained by c-Kit immunohistochemistry. The distribution of the interstitial cells of Cajal was observed by light microscope. Results: The ICC in aganglionic segments of colon from 2Hirchsprungs d
5、isease were decreased significantly and statistically than that in dilated and normal colon. Moreover, whole mount preparations showed that, not only the number of ICC-IM was decreased down, but also the branches of ICC-IM and the cellular network were also broken down. Conclusion: The pathogenesis
6、of HD is related to the abnormal distribution of ICC，which lead to or aggravate the bowel spasm in HD.【KEY WORDS】 Hirschsprungs diseaseInterstitial cells of CajalImmunohistochemistry先天性巨结肠（Hirschsprungs disease, HD）是小儿普通外科常见病，由于病变肠段神经节细胞缺如，平滑肌过度收缩呈痉挛状态，蠕动消失，肠腔内粪便不能通过痉挛部位，近端结肠继发性扩张，形成巨结肠，临床上出现肠梗阻或便秘症
7、状。1893 年西班牙神经解剖学家 Cajal 采用甲基蓝及嗜银染色法发现了存在于胃肠道的一种特殊类型的细胞, 被称为 Cajal 间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）。ICC 是胃肠道运动的起搏细胞，具有自发性电活动和产生传播慢波等功能，对胃肠道运动具有非常重要的调节作用。ICC 的变化与多种胃肠动力疾病有关。本研究通过 c-Kit 免疫组织化学染色，光镜观察 ICC 在正常结肠和巨结肠患者扩张段、移行段、痉挛段的分布，探讨 ICC 在 HD 致病中的作用。1 资料与方法1.1 一般资料 收集山东省立医院、山东大学齐鲁医院 2005 年 5 月2007
8、年 10月 25 例 HD 患儿手术切除组织，其中男 22 例，女 3 例。平均年龄 23 个月，2周3 个月 4 例，3 个月3 岁 16 例，3 岁 5 例。长段型 2 例，短段型 2 例，其余均为普通型。所有病例综合临床表现、X 线钡剂灌肠和手术所见，并经术中冰冻术后病理组织学检查确诊为 HD，病例资料完整，均为散发。手术切除的扩张段、3移行段、痉挛段全层肠壁组织经 4%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，以扩张段组织蜡块作自身对照。另取 6 例正常结肠组织作为对照，其中 3 例为乙状结肠冗长症患儿切除的部分结肠组织，2 例为肠扭转肠坏死患儿切除的部分升结肠组织，1 例为回盲型肠套叠患儿手术切除
9、组织。1.2 主要试剂和方法 兔抗人 c-Kit 多克隆抗体 IgG，购自上海长岛生物抗体有限公司；SP 免疫组织化学染色试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。组织蜡块行 SP 法免疫组织化学染色。每个蜡块连续切片 3 张，厚 34 m；切片常规脱蜡至水；3%过氧化氢去离子水室温孵育 510 min；蒸馏水冲洗，PBS浸泡 5 min，微波抗原修复。正常山羊血清工作液封闭，室温孵育 10 min，倾去血清，勿洗；滴加 1:50 稀释的一抗，37 孵育 2 h；PBS 冲洗 3 次 ；滴加生物素标记羊抗兔 IgG 二抗工作液，37 孵育 15 min；PBS 冲洗 3 次。滴加 PBS 稀释
10、的辣根酶标记链霉卵白素工作液, 37 孵育 15 min；PBS 冲洗 3 min，共 3 次；DAB 显色，苏木精复染，封片。以试剂盒附送阳性片作为阳性对照，以 PBS 液代替一抗作为阴性对照。1.3 观察指标 由有经验的病理医师在高倍镜（400）下观察全部病理切片的肌间、黏膜下各 10 个视野，了解 ICC 的分布情况并计数。1.4 统计学处理 全部数据经 SPSS 13.0 统计软件分析。HD 扩张段、痉挛段与对照组行成组设计两样本均数比较的 t 检验，扩张段与痉挛段之间行配对设计资料 t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果42.1 不同结肠组织内 ICC 的分布 正常结肠组
11、织内可见两类 c-Kit 阳性细胞：一类细胞胞体较大，呈圆形，主要分布于黏膜层和黏膜下层，在肌层内和浆膜下分布稀少，根据形态可识别为肥大细胞（图 1）。另一类细胞胞体较小，呈梭形或多角形；细胞质相对较多，可见棕色颗粒；核呈深蓝色，圆形或椭圆形，此为 ICC。ICC 细胞主要为多极细胞，少数为双极细胞，细胞有 23 个细长突起，彼此借突起相互连接。分布在纵肌与环肌之间的肌间神经从周围的 ICC 称之为肌间 ICC（myenteric ICC, ICC-MY)，细胞借突起形成网络状结构；位于黏膜下环形肌层表面的 ICC 称之为黏膜下 ICC（submucosal ICC , ICC-SM)，细胞多
12、为双极细胞，借突起相互连接于黏膜下层和环肌层形成明显的界面；分布在环肌、纵肌内的 ICC 称之为肌内ICC（intramuscular ICC , ICC-IM）,有的与平滑肌平行走行，有的与平滑肌交叉，数量较少，彼此之间未见相互连接（图 2）。 ICC 在 HD 患儿病变结肠各段的分布不同。扩张段病变结肠 c-Kit 阳性表达细胞数量和形态与正常结肠无明显差别，根据形态可识别肥大细胞和 ICC。ICC 主要为 ICC-MY 和 ICC-SM，彼此之间相互连接形成网络状结构或形成一界面，ICC-IM 数量较少（图 3）。痉挛段病变结肠 c-Kit阳性表达细胞明显减少,彼此之间的网络状结构被破坏
13、，ICC-SM 亦明显减少，彼此之间连接消失；ICC 细胞形态与扩张段和正常结肠相似，仍呈梭形或多角形（图4）。移行段病变结肠 c-Kit 阳性表达细胞数量介于扩张段与痉挛段之间。2.2 不同结肠组织内 ICC 数量的比较 正常结肠组织、HD 扩张段、HD 痉挛段的 ICC-MY 数量分别为（13.172.17）、 （11.123.28）、 （2.161.70）；ICC-SM 的数量分别为（6.561.18）、 （8.332.16）、 （1.881.56）。正常结肠组织与 HD 扩张段 ICC-MY数量比较，差异无统计学意义（t=1.057 6,P=0.2990）； ICC-SM 数量比较，差
14、异亦无统计学意义（t=1.791 5, P=0.0837）。正常结肠组织 ICC-MY 和 ICC-SM 数量均多5于 HD 痉挛段，差异有统计学意义（t=10.432 5, P0.01；t=8.443 3, P0.01）。HD扩张段 ICC-MY 和 ICC-SM 数量均多于痉挛段，差异有统计学意义（t= 9.316 5, P0.01；t= 9.778 3, P0.01）。3 讨论HD 是常见的小儿普通外科疾病，患儿胃肠道平滑肌过度收缩甚至痉挛，蠕动消失，肠腔内粪便滞留，近端结肠继发性扩张，形成巨结肠，临床上主要表现为肠梗阻或便秘症状。ICC 是胃肠道运动的起搏细胞，对胃肠道运动具有非常重要
15、调节作用。HD 患儿多伴有病变结肠组织 ICC 的缺如。既往应用甲基蓝和嗜银染色、金属掺合剂、NADPH黄递酶染色以及碘化锌四氧化锇酸法对 ICC 进行检测，但这些方法均缺乏特异性。真正的检测依赖于显微镜，这在一定时期内限制了对 ICC 的研究。ICC 的基因表达产物 c-Kit 可以作为一种化学标志物与其他细胞区别开。c-Kit 是酪氨酸激酶受体，具有细胞外、细胞膜和细胞质内 3 个部分。细胞外的部分为肝细胞因子（stem cell factor，SCF）的受体区,细胞内部分为酪氨酸激酶区。SCF 与 c-Kit 结合活化了酪氨酸激酶,导致一系列磷酸化过程,从而影响细胞的生长和分化。人类肠道
16、组织中 c-Kit 免疫组织化学染色仅能标记两种细胞，即肥大细胞和 ICC。本研究发现，正常结肠组织内 c-Kit 阳性细胞有较高的表达率，主要分布于肌间和黏膜下，密度明显高于环肌与纵肌内。通过形态可以区别肥大细胞和 ICC，肥大细胞较大呈圆形，具有圆形的细胞核，细胞质丰富。ICC 呈梭形，多为多极细胞，少数为双极细胞，具有卵圆形细胞核。位于肌间的 ICC 彼此借突起相互形成网络状结构，黏膜下的 ICC 连接形成一明显的界面。6胃肠运动依赖神经元、ICC 和平滑肌细胞的正常功能。ICC 产生的基本电节律起关键作用。ICC 是胃肠慢波活动的起搏器。Koh 等将在分离培养的 Balb/c小鼠的小肠 ICC 上用膜片钳技术记录到了有节律性、规则的慢波样去极化波形，其波形与宽度均与胃肠道平滑肌肌条上记录的慢波相似。但小肠 ICC 与平滑肌细胞电生理特性不同，ICC 在膜电位时即表现出自发性电压振荡（voltage oscillation），节律性电活动不被超极化和 L-型钙通道阻滞剂所阻
