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1、1BAG-1 蛋白在非小细胞肺癌中的表达及 其与预后关系的研究【摘要】 目的 研究 BAG-1 蛋白在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）中的表达及其与患者临床特征和预后的关系。方法 应用免疫组化的方法检测 125 例 NSCLC 术后石蜡标本中 BAG-1 蛋白的表达情况，随访后进行生存预后分析。同时选择 10 例肺炎性假瘤作对照组观察其表达情况。结果 BAG-1 蛋白在 NSCLC 组织中存在高表达（阳性率为 64.8 %）； BAG-1 蛋白表达水平与组织学分级相关，分级越差，其阳性表达率越高（P = 0.031）；多因素 Cox 风险模型分
2、析 BAG-1 是独立的预后因素； BAG-1 蛋白阳性患者具有生存优势（P = 0.044），且 BAG-1 在胞浆中的表达具有更低的死亡风险（P = 0.039），BAG-1 蛋白表达阳性组患者的中位生存时间及 5 年生存率均高于阴性表达组，差异有统计学意义（P0.05）。结论 BAG-1 蛋白是 NSCLC 独立的预后因素且其表达与预后相关，可能成为新型的临床预后指标。 【关键词】 BAG-1；非小细胞肺癌；预后Abstract：Objective To detect the correlation between the expression of BAG-1 and prognost
3、ic significance in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods The expression of BAG-1 is measured by immunohistochemistry in paraffin sections of 125 NSCLC postoperative patients , then we analyze the existence and prognosis . At the same time, select 10 patients with pulmonary inflammatory pseudot
4、umor as control group to observe the expression. Results （1）BAG-1 protein stands high expression in NSCLC (positive rate 64.8%).(2)The expression levels of BAG-1 correlates with cell splitting. The lower the splitting, the higher the rate of positive expression（P= 0.031）. (3)Cox multifactors model a
5、nalysis indicates that BAG-1 acts as an independent prognostic factor in NSCLC.(4)Sufferers with BAG-1 positive expression have the survival advantage（P=0.044）. In addition, patients whose tumor exhibits cytoplasmic staining have a further reduction of the risk of death （P=0.039）. The median surviva
6、l time and 5-year survival rates in patients with positive BAG-1 protein expression is 2higher than that in patients with negative BAG-1 protein expression. The difference has a statistic significance（P0.05）. Conclusions BAG-1 is an independent prognostic factors and correlated with their expression
7、 and prognosis in NSCLC. It may become a new indicator of prognosis.Key words:BAG-1；NSCLC；prognosis肺癌是全球发病率和死亡率最高的肿瘤，且一直呈上升趋势，其中约 80 %为 NSCLC。细胞凋亡缺陷或受阻是肺癌发生发展的重要原因1，但其机制复杂，涉及很多基因和蛋白。研究发现，BAG-1 ( BCL-2 Associated athanogene 1)是多功能相关蛋白，与多种基因蛋白产物相互作用来调节细胞的凋亡和增殖。其在正常组织中不表达或弱表达，而在乳腺癌、大肠癌、肺癌等恶性肿瘤中都有表达, 且在
8、不同肿瘤中的意义也不尽相同2，与预后的关系也尚未明确。因此肿瘤细胞中BAG-1 蛋白的表达与其临床意义方面的研究已成为目前研究的热点之一。为进一步探讨 BAG-1 蛋白在 NSCLC 中的表达及意义，我们应用免疫组织化学方法检测 125 例 NSCLC 标本中 BAG-1 蛋白的表达，并分析其与临床特征和预后的关系。1 资料和方法1.1 研究对象一般资料本实验所有研究对象为 2000 年 1 月至 2004 年 1 月在辽宁医学院附属第一医院胸外科手术治疗后经两名资深的病理医生明确诊断为 NSCLC 的患者 125 例。其中男性 69 例，女性 56 例，年龄范围 3179 岁，中位年龄 54
9、 岁。其中腺癌 70 例（高-中分化 42 例、低分化 28 例）、鳞癌 55 例（高-中分化 37 例、低分化 18 例）；期 70 例、期 23 例、期 32 例（AJCC 2002 年分期标准）；有转移者 58 例、无转移者 67 例；另取 10 例肺炎性假瘤标本作对照组。所有标3本均经 10 % 福尔马林固定，常规石蜡包埋后存档。1.2 随访和评价指标所有患者均采用电话或者门诊随访的方式。随访时间为从患者手术后到 2008 年 5 月 26 日或由于复发、转移及其他原因死亡的日期。所有患者平均随访 6.4 年，中位随访时间为 63 个月。随访时重新行胸部 CT 等检查，所有病例均有完整
10、的随访资料。评价指标：总生存期（overall survival，OS）；中位生存期 （median survival time，MST）；生存率（survival rate，S）。OS：定义为患者手术的日期至由于复发、转移及其他原因死亡的日期或最后一次随访的日期。MST：指生存率为 50 % 时对应的生存时间。S：指观察对象活过 tk 时刻的概率。1.3 实验材料和方法1.3.1 免疫组化试剂兔抗人 BAG-1 多克隆抗体 (克隆号：C-16 产品号：SC - 939 工作浓度 1：150 santa cruz 公司产品)、即用型 PV 二步法（PV - 9000）免疫组化试剂盒、浓缩型 D
11、AB 试剂盒、磷酸盐缓冲液 PBS (0.01 M，pH 7.27.4)、柠檬酸抗原修复液（0.01 M，pH 6.0）。以上试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.3.2 免疫组化染色本实验所有患者组织切片均应用免疫组化 PV 二步法。用已知的 BAG-1 蛋白阳性片做阳性对照，用 PBS 代替一抗作阴性对照。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。41.3.3 结果判定观察结果采用双盲法。用 Greenspan 半定量法对阳性细胞百分率及细胞染色强度进行评分：每张切片在 5 10 个高倍镜视野下进行细胞记数，每个视野记数100 200 个细胞，共 1 000 个细胞，计算出每张切片阳性细胞数所
12、占的比例。以定位明确的阳性表达细胞 25 % 为 1 分，25% 50 % (包括 25 %) 为 2 分，50 % 75 % (包括 50 %) 为 3 分， 75 % 为 4 分；以阳性细胞染色深度出现淡黄色为 1 分，黄色为 2 分，棕黄色为 3 分；将每一标本两项得分相乘得出总分 04 分记为-，58 分记为 +，9 12 分记为 + 。所有切片均有 2 名观察员进行观察评分。1.4 统计学分析应用 SPSS16.0 软件处理数据。用 2 检验进行两个样本率的比较，Kaplan-Meier 方法进行生存分析，用 Log-rank test 进行生存曲线分析，用 Life-table 法
13、进行生存率的计算，用 Cox 风险模型进行预后因素分析。检验水准确定 P 0.05 为有统计学意义。2 结 果2.1 BAG-1 蛋白表达情况BAG-1 蛋白主要在细胞核和（或）细胞浆表达，125 例 NSCLC 术后患者 BAG-1蛋白表达阳性 81 例，阳性率为 64.8 %（44 / 81），10 例肺炎性假瘤 BAG-1 蛋白表达阳性 1 例，阳性率为 10 % (1/10)，差异有统计学意义（P= 0.001）。BAG-1 蛋白表5达分为胞浆和胞核、胞浆、胞核表达三种，BAG-1 蛋白在胞浆中阳性表达率越高，患者死亡风险越低，生存时间越长（P= 0.039）（见图 15）。2.2 B
14、AG-1 蛋白表达与临床病理特征之间的关系BAG-1 蛋白表达水平与组织学分级相关，组织学分级越高其阳性表达率越高（P= 0.031），与患者的性别、年龄、病理类型、分期及淋巴结转移差异无统计学意义 ( 见表 1 )。2.3 多因素 Cox 风险模型分析多因素 Cox 风险模型分析表明，BAG-1、分期及组织学分级均是独立的预后因素，P 值分别为 0.021、0.015、0.025（见表 2）。2.4 各组间不同 BAG-1 蛋白表达的生存分析Log-rank 生存分析表明：BAG-1 蛋白表达阴性、阳性时的 OS 差异均有统计学意义（P= 0.044），BAG-1 蛋白表达阴性时 NSCLC
15、 预后较差。Life-table 结果分析：BAG-1 蛋白阴性表达组的 44 例患者的 MST 为 37.5 月，5 年生存率为 29.5 %（13 / 44）；而 BAG-1 蛋白阳性组的 81 例患者中 MST 为 49.3 月，5 年生存率为 38.3 % ( 31 / 81)，差异均具有统计学意义（P0.05）， （见图 6）。表 1 BAG-1蛋白的表达与 NSCLC 临床特征之间的关系临床参数 BAG-1 蛋白表达总数-+2P性别男性 表 2 NSCLC 患者的 Cox 多因素生存分析模型变量 VFHRwaldP-Value年龄3 讨 论6BAG-1 基因是 Takayama 等
16、人3于 1995 年在对人淋巴细胞株 Jurkat 筛检与BCL-2 蛋白相结合的蛋白时发现的，BAG-1 蛋白为多功能结合蛋白，系抗凋亡基因，可与多种信号因子（BCL-2、HSP70、RAF 等）相互作用，发挥细胞凋亡、信号传导、细胞增殖、基因转录及细胞运动等调节通路。由 BAG-1 调节的途径在肿瘤的发生和发展过程中起重要作用，与肿瘤形成和化疗耐药相关4。为作为多种肿瘤的新型临床预后指标和治疗靶点提供了可能。目前，BAG-1 蛋白在肺癌中的表达及其与预后的关系尚存在争议。Rorke 等5应用免疫组化的方法观察了 85 例非小细胞肺癌患者肿瘤组织中 BAG-1 蛋白表达情况，结果表明，BAG-1 蛋白表达的强度和亚细胞分布与总生存期呈正相关。BAG-1 蛋白在胞浆中阳性表达率越高,患者死亡风险越低，且其表达水平与患者的年龄、肿瘤分期及组织学类型无关。Cox 风险模型分析表明，这些患者 BAG-1蛋白过度表达显著降低死亡危险 （HR = 0.53，P 值 0.03）。Kaplan-Mei
