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1、1CDR3 导向抗体库法人源化抗膀胱癌 Fab 的鉴定【摘要】 目的: 对通过 CDR3 导向抗体库法筛选到的 3 株人源化膀胱癌噬菌体抗体进行进一步分析鉴定。方法: 用 ELISA 方法对筛选特异性克隆进行特异性鉴定、 抗原表位的核实; 采用硫氰酸盐洗脱 ELISA 法评估其亲和力; 选用活性较高的克隆进行膀胱癌组织的免疫组化实验。结果: 3 株阳性克隆可溶性表达后能够与膀胱癌 EJ 细胞特异性结合; 与鼠源噬菌体抗体(BDI)相比, 2 株克隆的亲和指数比较低, 均为 0.25 mol/L, 1 株克隆的亲和指数为 0.7 mol/L, 略低于鼠源的亲和指数（0.9 mol/L）的水平。选
2、择活性较高的克隆进行膀胱癌组织的免疫组化实验, 显示该克隆能够与癌组织特异性结合。结论: 用 CDR3 导向库法获得的人源抗体片段基本保持了原鼠源单克隆抗体(mAb)BDI 的特性。 【关键词】 抗膀胱癌单克隆抗体 噬菌体抗体库 鼠单克隆抗体人源化单克隆抗体(mAb)在许多领域得到极为广泛的应用, 但由于其鼠源性, 限制了在临床治疗方面的应用, 近几年由于人源化和人源抗体研制技术的进展才得以迅速发展。目前, 对鼠 mAb 进行人源化改造有多种方案。以噬菌体抗体库技术为基础的“抗原表位定向选择法” 是近年来发展起来的一种鼠 mAb 人源化新方法1, 2。该方法通过鼠-人轻重链可变区杂合配对, 用
3、抗原进行亲和筛选, 最终得到与亲本鼠 mAb 识别相同抗原表位的人源抗体。该方法能够确保所筛选到的抗体为人源抗体, 不含鼠源序列。但所获人源 mAb 的特异性及亲和力难以得到保证, 有时所获人源抗体与抗原的结合活性会产生漂移, 与亲本鼠 mAb 有所不同。CDR3导向抗体库法是在“抗原表位定向选择法”的基础上尝试的一种新方法。该方法通2过构建含鼠 mAb CDR3 区基因的人源抗体库, 并利用 cre-loxp 定位重组系统构建大容量抗体库, 直接筛选与亲本鼠 mAb 特异性相同的人源抗体。运用该方法我们尝试人源化抗膀胱癌鼠 mAb BDI, 获得 3 株人源噬菌体抗体 Fab 基因, 并证实
4、筛选到的克隆与亲本鼠 mAb 识别相同的抗原表位3。本研究中, 我们将对其特性作进一步分析鉴定。1 材料和方法1.1 材料 抗膀胱癌噬菌体抗体由本室运用 CDR3 导向抗体库法筛选获得, 抗膀胱癌人-鼠嵌合抗体（cBDI）、 抗乙肝表面抗原 Fab (HBsAg Fab)、 大肠杆菌菌株、 VCSM13、 L929 细胞由本室制备保存4; 抗膀胱癌鼠 mAb (BDI)、 膀胱癌细胞株（EJ）由北京大学医学部泌尿研究所俞莉章教授提供; 限制性内切酶为TaKaRa 公司产品; 各种酶标抗体购自 Promega 公司和 Sigma 公司。1.2 方法1.2.1 可溶性 Fab 抗体的表达及检测 参
5、照文献5介绍的方法构建和表达可溶性 Fab 抗体, 并按照文献6介绍的方法接种膀胱癌 EJ 细胞及 L929 细胞于 96孔板, 以 HRP-羊抗人 Fab 为二抗, 检测上清中人 Fab 与膀胱癌细胞的结合活性及特异性。1.2.2 相对亲和力的测定 （1）测定硫氰酸铵(NH4SCN)对 EJ 细胞抗原的影响: 接种 EJ 细胞于 96 孔板培养过夜, 用 2.5 mL/L 戊二醛或丙酮/无水乙醇（11）固定细胞, 30 g/L 的脱脂牛奶-PBS（MPBS）37封闭 1 h, 加入不同浓度（02.0 mol/L）的 NH4SCN, 室温静置 15 min, PBS 洗 3 次, 加入相同浓度
6、的鼠 mAb (BDI)和嵌合抗体（cBDI）, 50 L/孔, 37孵育 1 h, 0.5 mL/L Tween-20/PBS 洗 3 次, 加入HRP-羊抗鼠或 HRP-羊抗人 Fab(12 000), 37孵育 1 h, 再经洗涤后 OPD 显色。3（2）用 NH4SCN 洗脱法测定相对亲和力: 种植于 96 孔板的 EJ 细胞经固定及封闭后, 加入待测抗膀胱癌 mAb Fab 噬菌体上清 50 L/孔, 37孵育 1 h, 0.5 mL/L Tween-20/PBS 洗 3 次, 加 50 L/孔不同浓度的 NH4SCN, 室温静置 15 min, PBS洗 3 次, 加入 HRP-抗
7、 M13（15 000）37孵育 2 h, 再经洗涤后 OPD 显色, A490计数。抗体与抗原结合的 A490 值在经洗脱后下降至 50%的 NH4SCN 浓度即为该抗体的亲和指数, 以 mol/L 表示7。1.2.3 免疫组化实验 取临床病理确定的膀胱癌标本的石蜡切片脱蜡后, 蒸馏水洗涤 5 min3 次, 将切片放入盛有枸橼酸盐的缓冲液（pH6.0）的容器中, 置微波炉内加热, 在 9295之间持续 1015 min, 室温冷却 1020 min。蒸馏水冲洗, PBS 浸泡 5 min。50 g/L 山羊血清封闭 1 h, 加入待测的抗体, 4冰箱放置过夜。次日, PBS 冲洗 5 mi
8、n3 次, 加 HRP-抗 M13 或 HRP-羊抗人 Fab, 室温放置 2 h, 继续 PBS 冲洗 5 min3 次, 加入 DAB 显色, 复染, 封片。2 结果2.1 可溶性 Fab 抗体的表达及检测 将获得的 3 株人源抗膀胱癌噬菌体抗体以 Nhe I 酶切, 除去噬菌体抗体表达载体中的基因片段, 得到可溶性 Fab 段的表达质粒, 用其转化大肠杆菌 XL1-Blue, 经阿拉伯糖诱导制备可溶性 Fab 上清, 用 HRP-羊抗人 Fab 进行 ELISA 检测, 证明该 Fab 段能特异地与 EJ 细胞结合（表1）。 表 1 可溶 Fab 与 EJ 细胞结合的 ELISA（略）2
9、.2 相对亲和力的测定 硫氰酸铵洗脱法是比较不同抗体相对亲和力的一种方法8。一般常用于比较可溶性单一抗原的相对亲和力, 为确定其是否能够用于本实验中, 首先检测了不同浓度硫氰酸铵对 EJ 细胞的影响。结果显示在 2 mol/L 浓4度下, 硫氰酸铵对固相化 EJ 细胞的抗原性无影响（图 1）。图 1 硫氰酸铵对固相化 EJ 细胞抗原的影响（略）在此基础上现用该方法比较了所获人源与鼠源 BDI 噬菌体抗体的相对亲和力, 表明经过 CDR3 引导所获得的人源抗体阳性克隆中, 其中的 2 个克隆的亲和指数比较低, 均为 0.25 mol/L, 1 个克隆的亲和指为 0.7 mol/L, 接近于鼠源的
10、亲和指数（0.9 mol/L）的水平（图 2）。图 2 抗体相对亲和力的测定（略）2.3 肿瘤组织免疫组化实验 为进一步确定所筛选的人源抗体的特异性, 现又用确诊的膀胱癌组织的石蜡切片进行了免疫组化实验, 其所筛选到的人源抗膀胱癌抗体能够与膀胱癌组织特异结合（图 3）。图 3 免疫组化鉴定人源抗膀胱癌抗体 Fab（SP, 100）（略）A: 正常组织; B: 膀胱癌组织.3 讨论BDI 是一株对膀胱癌细胞具有高特异、 高亲和性的抗膀胱癌 mAb, 在放射免疫诊断和治疗试用中取得良好的效果。为使其更好的用于临床, 在克隆 BDI 轻、 重链基因的基础上, 通过构建含鼠 mAb BDI CDR3
11、区基因的人源抗体库, 利用cre-loxp 定位重组系统构建大容量抗体库。用 EJ 细胞对所获的抗体库进行筛选, 获得了 3 株与 EJ 细胞具有特异结合活性的人源化的噬菌体抗体。与嵌合抗体的竞争抑制实验显示所获的噬菌体抗体与亲本鼠 mAb 识别相同的抗原表位。通过5对所获阳性克隆可变区序列测定, 显示所获得的克隆均为人源 Fab, 抗体的基因与人胚系免疫球蛋白基因库中的基因有极高的同源性。在本实验中, 当把得到的 3 个克隆表达为可溶性 Fab 分子后, ELISA 结果显示, 尽管 3 个克隆均能够与 EJ 细胞特异性结合, 只有一株可溶性克隆显示出较高的特异性, 可能是噬菌体抗体利用噬菌
12、体展示技术将抗体蛋白展示在噬菌体表面, 噬菌体表达的抗体数量有几倍得到几十倍的放大, 结果显示亲和力高9。说明尽管用 CDR3 导向抗体库法能够获得与鼠 mAb 识别相同表位的人源抗体, 要想获得具有高亲和力的具有临床应用前景的抗体, 还需进一步进行体外亲和力成熟实验。在本实验中, 我们还运用硫氰酸铵洗脱法比较了所获人源与鼠源 BDI 噬菌体抗体的相对亲和力, 尽管结果显示其中一个克隆的亲和指数为 0.7 mol/L, 接近于鼠源的亲和指数（0.9 mol/L）的水平, 由于噬菌体抗体具有一定的放大效应, 要想得到准确的结果, 还需进一步试验验证, 相关工作正在进行中。【参考文献】1 Jesp
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14、J Immunol Methods, 2000, 241(1-2): 171-184.3 周丽君, 王 琰, 王 堃, 等. 用 CDR3 导向抗体库法对鼠抗人膀胱癌单抗进行人源化J. 中华微生物学和免疫学杂志, 2004, 24(2): 150-154.4 白 银, 王 琰, 周丽君, 等. 抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达J. 北京大学学报（医学版）, 2001, 33（5）: 402-406.65 李 竟, 王 琰, 王卓智, 等. 抗胃癌鼠单抗 3H11 Fab 段载体的构建、 表达及抗体活性检测J. 中华微生物学和免疫学杂志, 1999, 19（2）: 158-161
15、.6 周丽君, 白 银, 王 琰, 等. 抗膀胱癌单抗 Fab 段基因的克隆及表达J. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2002, 9(2): 117-121.7 王 刚, 王 琰. 用硫氰酸盐洗脱法筛选高亲和力噬菌体抗体J. 中国免疫学杂志, 2002, 18（2）: 93-95.8 Pullen GR, Fitzgerald MC, Hosking CS, et al. Antibody avidity determination by ELISA using thiocyanate elutionJ. J Immunol Methods, 1986, 86（1）: 83-87.9 汪保安, 陈晓穗, 王欲晓, 等. 通过随机突变提高抗 TNF- 单链抗体的亲和力J. 细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21(4): 445-448.
