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1、1survivin 启动子的克隆及其在前列腺癌 细胞系中的活性鉴定作者：骆晓梅，张南征，刘家云，苏明权，郝晓柯【摘要】 目的 克隆 survivin 启动子片段，并检测其在人前列腺癌细胞中的转录活性，为该启动子在前列腺癌靶向基因治疗中的应用提供实验依据。方法 PCR 方法扩增 survivin 基因启动子 S1pro 和 S2pro，克隆入 pGL3-Basic，分别构建重组质粒 pGL3-S1pro 和 pGL3-S2pro，脂质体转染前列腺癌细胞和 Chang liver 肝细胞，检测 survivin 启动子在细胞中的转录活性。结果 survivin 基因启动子在前列腺癌细胞中均具有较强
2、活性，其中 S2pro 活性明显高于 S1pro，达到 CMV 启动子活性的三分之一。结论 survivin 启动子在前列腺癌细胞中具有较强启动活性，有可能成为新的前列腺癌靶向性基因治疗工具。 【关键词】 前列腺癌；基因；survivin；启动子；基因治疗Abstract: Objective To clone DNA sequence of survivin promoter, and detect its transcriptional activities in human prostate cancer cells. Methods The fragment of survivin p
3、romoter was acquired by PCR amplification and was inserted into pGL3- Basic to reconstruct recombinant plasmids pGL3-S1pro and pGL3-S2pro, respectively. The reconstructed plasmids were transiently transfected into human prostate cancer cell lines LNCap, PC-3 and normal Chang liver cells. The transcr
4、iptional activities of survivin promoter in various cel1s were determined by detection of the expression of luciferase. Results Survivin promoter had transcriptional activities in all prostate cancer cell lines and the transcriptional activity of the S2pro was much higher than the S1pro and reached
5、a level of one third of the transcriptional activity of the CMV promoter. Conclusion The survivin promoter cloned in this study was more highly activated in prostate cancer cells than in normal cel1s, which might enable it to be a potential candidate promoter in the gene therapy of prostate cancer.K
6、ey words: prostate cancer; gene; survivin; promoter; gene therapy2随着现代分子生物学技术的发展，靶向性基因治疗已成为前列腺癌治疗研究的热点，而寻找高效特异的启动子则是基因治疗研究的关键。本实验通过构建survivin 基因启动子调控的真核表达载体,转染前列腺癌细胞，探讨并评价 survivin启动子作为前列腺癌特异性启动子的可能性，为进一步将其应用于前列腺癌靶向基因治疗研究打下基础。1 材料和方法1.1 材料 荧光素酶报告基因载体 pGL3-Basic、含有 CMV 启动子的 p3.1-LUC（张翔等构建1）、前列腺癌细胞系 L
7、Ncap、PC-3 和正常肝细胞系 Chang liver 均购自中科院上海细胞所，本室保存。DNAZOL 和 RPMI 1640 为 Gibco 公司产品；DNA 聚合酶、Sac、Hind和 T4 DNA 连接酶为 Takara 公司产品；脂质体Lipofectamine 2000 为 Invitrogen 公司产品；质粒纯化试剂盒及胶回收试剂盒为Promega 公司产品。其他试剂均为国产或进口分析纯。1.2 方法1.2.1 survivin 基因启动子引物的设计和合成 根据 GenBank 中 survivin 启动子序列及引物设计原则，设计 survivin 启动子两对引物，分别扩增 s
8、urvivin 启动子基因片段 S1（第-2681 位）和片段 S2（第-26830 位）。上、下游引物 5端分别含有 pGL3-Basic 载体多克隆位点中包含的 Sac和 Hind限制性内切酶序列。上游引物 P1，5-ACGGTCGACCGCGTTCTTTGAAAGCAGTC-3。下游引物分别为：P2，5-TATAAGCTTTGCCGCCGCCGCCACCTCT-3；P3，5-TATAAGCTTCCAGGCAGGGGGCAACGT-3。引物由北京奥科生物技术公司合成。1.2.2 PCR 扩增及鉴定 DNAZOL 自 LNcap 细胞提取基因组 DNA，以此为模3板进行聚合酶链反应（PCR）
9、，分别扩增 survivin 启动子 S1 和 S2 片段。反应条件为：95预变性 5 min，94变性 30 s，53退火 30 s，72延伸 60 s，30 个循环，72延伸 7 min。PCR 产物经 2琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收试剂盒回收得到survivin 启动子片段。与 pMD18-T 测序载体连接，送北京奥科生物技术公司测序。1.2.3 pGL3 重组质粒的构建 Sac和 Hind双酶切测序正确的含有 survivin启动子的 pMD18-T 载体和 pGL3-Basic 载体，回收的片段用 T4 DNA 连接酶 16连接过夜，将连接产物转化 E.coli DH5 感受态细胞,在
10、 Amp 抗性平板上筛选重组质粒。用 Sac和 Hind双酶切鉴定并送公司 DNA 测序。测序正确的重组质粒命名为 pGL-S1pro、pGL-S2pro。1.2.4 重组质粒的活性分析 分别将 pGL-S1pro、pGL-S2pro、p3.1-LUC 及阴性对照质粒 pGL3-Basic 转染前列腺癌细胞系 LNCaP、PC-3 和正常肝细胞系 Chang liver，以未转染质粒的细胞为未转染对照组，同步进行实验。各组同时转染含有海肾荧光素酶的载体 pRL-TK 为内参照。各转染组每孔质粒用量为 0.8 g，同时各孔加入 pRL-TK 0.1 g，脂质体用量为 2 l，每组设 3 个平行孔
11、。培养 48 h 后裂解细胞，加入荧光素酶检测试剂，在 TD-20/20 荧光检测仪上对荧光作定量测定。为消除转染效率带来的影响，同时转染 pRL-TK 质粒检测光密度（D）以校正转染效率。2 结果2.1 PCR 扩增 S1 全长为 269 bp，S2 全长为 298 bp。2%琼脂糖凝胶电泳检测结果中可见清晰的扩增条带，片段大小与预计相符（图 1-A）。2.2 重组质粒 pGL-S1pro 和 pGL-S2pro 的鉴定 经 Sac、Hind双酶切后分4别可见到大小约 270 bp 和 300 bp 的 survivin 启动子基因片段（图 1-B）。结果与设计相符，测序结果与目的基因组一致
12、图 1 电泳结果（略）M. DNA Marker； 1. S2pro； 2. S1pro a. pGL-S1pro； b. pGL-S2pro2.3 重组质粒荧光素酶活性分析 荧光定量测定结果表明：带有 CMV 启动子的阳性对照载体 p3.1-LUC 质粒转染所有细胞 48 h 后，荧光素酶活性均达到较高水平；携带有 survivin 基因启动子的重组质粒转染细胞 48 h 后 PC3 和 LNCap 细胞中，荧光素酶活性也均达到较高水平，但比 CMV 启动子仍为低，其中 pGL3-S2pro 较 pGL3-S1pro 活性强，接近 CMV 启动子活性的 30，pGL3-S1pro 活性仅为 pGL3-S2pro 活性的 2030；而在正常肝细胞系 Chang liver 中荧光素酶活性均很低，与 pGL3-Basic 无显著差别。见图 2。图 3 重组质粒在各细胞中的荧光素酶活性比较（略）
