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1、1RECK 在宫颈癌中的表达及意义作者：王玲 韩丽英 王强 李荷莲【摘要】 目的 检测基质金属蛋白酶抑制剂 RECK 在宫颈癌组织中的表达，探讨其对血管生成的影响。方法 实验组(宫颈癌组织)26 例以及对照组(正常宫颈上皮、慢性宫颈炎组织)24 例，应用 S P 免疫组化法，经细胞计数及灰度测量检测RECK 的表达，计数微血管密度(MVD)的值。比较二者的差异性。结果 RECK 的表达在实验组的灰度值(7 848.741 276.04)明显低于对照组(657 282.830 681.16)(P0.05);RECK 在宫颈癌中表达与肌层浸润深度、盆腔淋巴结转移有关(P0.05)，而与临床分期、组
2、织学分型、组织学分级、脉管浸润无关(P0.05)。MVD 值在实验组(19.461 53.071 8)明显高于对照组(12.000 02.662 9)(P0.05);二者呈负相关关系，r=-0.397,P=0.049 5。结论 RECK 在宫颈癌组织中低表达;REKC 的高表达能抑制宫颈癌肿瘤血管生成。 【关键词】 RECK; 基质金属蛋白酶; 宫颈癌; 微血管密度恶性肿瘤侵袭正常组织及转移必须突破细胞外基质(ECM)尤其是基底膜屏障。而基质金属蛋白酶(MMP)在 ECM 及基底膜的降解过程中起到主导作用，能够促进肿瘤的侵袭转移和血管生成。MMP 抑制剂作为肿瘤治疗的新药物早已引起人们的重视。
3、RECK (reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs) 基因是近年来发现的新型 MMP 抑制剂，其转录后水平抑制 MMP 特别是MMP 2、MMP 9 以及膜型基质金属蛋白酶(MT1 MMP /MMP 14)的表达与活性，主要抑制肿瘤的血管生成以及侵袭转移1。国内外学者通过对乳腺癌、结肠2癌、前列腺癌等组织的体外实验研究表明：在恶性肿瘤组织中，RECK 的表达显著降低，并与肿瘤及淋巴转移有关;但对 RECK 与肿瘤的分期及分化程度关系意见不一致2，3。本实验主要探讨 RECK 在宫颈癌中的表达情况，及与宫颈癌发展、侵袭
4、及转移的关系以及对血管生成的作用，为宫颈癌的基因靶向治疗建立一个新的起点。1 资料与方法1.1 标本来源 选择 2007 年 3 月2008 年 3 月在吉林大学第二医院、吉林大学第一院、长春市妇产医院、省肿瘤医院进行手术治疗的 50 例患者的宫颈组织。分为试验组及对照组。试验组 26 例：经病理组织证实为宫颈癌，术前患者均未行放疗、化疗和免疫治疗，年龄 3372 岁，平均年龄(486.52)岁。其中期 19 例，a 期 4 例，b 期 2 例，a 期经 2 个疗程化疗后 1 例;高分化 9 例，中分化 13 例，低分化 4 例;鳞癌 21 例，腺癌 4 例，腺鳞癌 1 例;盆腔淋巴结转移 2
5、 例;脉管转移 2例。对照组 24 例，包括癌旁组织 16 例、慢性宫颈炎 8 例。两组在年龄上无统计学差异。1.2 试剂 鼠抗人 RECK 蛋白多克隆抗体购自美国 Santa Cruz 生物制品公司，鼠抗人因子单克隆抗体购自福州迈新生物技术有限公司，其他试剂采用进口或国产分析纯试剂。1.3 方法1.3.1 标本采集 广泛性子宫切除或全子宫切除标本，立即用 4预冷双刃刀片从宫颈组织上切取 1 cm3 大小组织，投入 10%甲醛溶液中，4保存，供制备光镜标本用。组织经固定、脱水、包埋、5 m 连续切片。31.3.2 实验方法 将切片进行 HE 染色和 S P 免疫组化。用 Image pro p
6、lus 6.0做灰度分析(IOD)，半定量计量 RECK 阳性率及 IOD 值，计数 MVD 值。1.3.3 结果判定 RECK 细胞计数判断标准：400 倍镜下观察，在肿瘤细胞膜和/或细胞质有黄棕色或玫瑰红色颗粒沉着为 RECK 阳性染色。根据染色程度和染色细胞百分率进行评分：基本不着色为 0 分，淡为 1 分，适中为 2 分，深为 3 分;着色细胞占计数细胞百分率5%为 0 分，6%25%为 1 分，26%50%为 2 分，51%为 3 分。将平均着色程度得分与平均着色细胞百分率得分相乘为其最后得分：1 分为阴性(-)，23 分为(+)，46 分为( )，6 分为( )。MVD 计数结果判
7、定标准：细胞间质内孤立的棕黄色血管内皮细胞或细胞簇或血管腔内径小于8 个红细胞直径且管壁无肌层者代表 1 条单独的微血管。先在低倍(100)视野下找到肿瘤组织内微血管密度最高的区域(热点)，然后在高倍(400)视野下计数 5个视野的微血管数，取其平均值。1.4 统计学方法 使用 SPSS11.0 进行数据分析，RECK 检测结果细胞计数以(- )表示，灰度分析以 IOD 均值及标准差表示，MVD 结果以均值及标准差表示。组间进行独立样本 2 检验、t 检验及双变量相关性分析。2 结 果2.1 宫颈癌组织及对照组中 RECK 的表达 RECK 在胞浆和胞膜处表达明显，宫颈间质中有适度表达，呈广泛
8、性弥漫(见图 1)。RECK 在宫颈癌组织中阳性表达11 例(42.31%)，而在对照组中呈高表达，阳性表达 22 例(91.67%)，组间比较有显著性差异(P=0.000 2)。26 例宫颈癌组织 IOD 为 7 848.741 276.04，24 例对照组为4657 282.830 681.16，经 t检验，宫颈癌组 IOD 值低于对照组，差异有统计学意义(t=2.570 5，P=0.000)(见表 1)。两种方法检验结果一致。2.2 宫颈癌组织中 RECK 表达与肌层浸润和淋巴结转移的关系 经组间 2 检验，RECK 在宫颈癌中表达与肌层浸润深度、盆腔淋巴结转移有关(P0.05)，而与
9、FIGO 分期、组织学分级和组织学分型无关(P0.05)。深肌层间质浸润、有盆腔淋巴结转移者，其 RECK 阳性表达率分别显著低于浅肌层浸润、无盆腔淋巴结转移者(P=0.018 4;P=0.023 7)。不同病理参数下 RECK 表达见表 2。 表 1 两组RECK 的表达表 2 RECK 的表达与宫颈癌临床病理参数的关系2.3 宫颈癌 MVD 的表达情况及与 RECK 的相关性分析 镜下观察血管染色结果，在宫颈癌组织中，微血管排列紊乱，着色不均一，大小不等，形状不规则，血管壁厚度不均(见图 2)，而对照组中血管内皮细胞表达较清晰，形状规则，呈圆形或椭圆形，管壁厚度均匀。宫颈癌组中 MVD 明
10、显高于对照组(P=0.000 0)。经线性回归分析，26 例宫颈癌组织 RECK 表达与 MVD 值呈负相关(r=-0.397,P=0.049 5)(见表 3)。表 3 宫颈癌和对照组中 MVD 的表达及与 REOK 的相关性分析 3 讨 论RECK 基因是由日本学者 Chiaki Takahashi 等人在转染了 v Ki Ras 基因的NIH3T3 细胞系表达的 cDNA 中分离出来的转录抑制基因。在正常组织或无肿瘤细胞系中广泛表达，而在癌基因转染的成纤维细胞或肿瘤细胞中低表达或无表达。RECK 在转录后水平抑制 MMP(特别是 MMP 2、MMP 9、MT1 MMP)的分泌与活性，还可以
11、抑制 pro MMP 9 和 pro MMP 2 从细胞内的释放，从而抑制肿瘤的血管生成、浸润和转移4。RECK 在正常组织中高表达，而在各种肿瘤来源5的细胞系及转染了 Ras 等癌基因的细胞中不表达。本研究表明，RECK 表达呈弥散状，呈棕黄色或棕褐色颗粒样物质，主要分布在胞膜和/或胞浆中，部分标本可见间质内表达。在对照组中，RECK 呈高表达，而在宫颈癌组织中 RECK 的阳性表达率显著降低(p=0.0002)。这与国内外报道相符。癌基因 HER 2/neu 可以抑制 RECK 的表达，说明 RECK 可能是癌基因作用的靶位点5。Cho2利用 DNA 甲基转移酶抑制剂(DNMT)5 氮胞苷
12、作用于被甲基化的 RECK，恢复其化学结构，结果 RECK 表达上调。说明癌组织中 RECK 被甲基化从而表达降低。Rabien 等指出 RECK 在前列腺癌中的表达明显低于前列腺增生组织6。Song 等3证实胃癌组织中 RECK 的表达与肿瘤的镜下生长(P=0.018)、淋巴浸润(P=0.018)、淋巴结转移(P=0.000)相关，随肿瘤侵袭能力增强而表达下降。本研究发现，RECK 基因的表达与宫颈癌 FIGO 临床分期、组织学分级、组织学分型、患者年龄无关，与癌组织肌层间质浸润深度、盆腔淋巴结转移相关。浸润深度累及深肌层或更深、盆腔淋巴结转移阳性组，RECK 表达明显下降(P=0.018
13、这 4,P=0.023 7)。Oh 等4用携带 RECK 基因的载体转染 HT 1080 人纤维肉瘤细胞并将其接种到裸鼠体内，发现肿瘤中血管密度降低，血管出芽受到抑制，血管腔增大。基因敲除研究发现，RECK 基因的适量表达可以抑制血管的生成。研究表明，RECK 作用的过程在于血管的成熟过程，而不是血管生成过程。有研究表明，TIMP 2 和Ala+TIMP 2 通过增强 RECK 表达介导的时间依赖机制抑制基质微血管上皮细胞(hMVEC)的迁移。TIMP 2 加强了 Crk 和 C3G 之间的信号传导，导致 Rap1 基因活性增加，与 Rap1 表达不活跃的细胞株相比，hMVEC 稳定表达。说明
14、6TIMP 2、Ala+TIMP 2、Rap1 基因能上调 RECK 的表达，使血管迁移减少7。本研究表明，RECK 表达阳性组织中微血管结构清晰，管腔增大且形状规则，呈椭圆或圆形，着色较深。而宫颈癌组织的微血管管壁菲薄且着色不均，管腔狭小且形状不规则;宫颈癌组织中 MVD 值明显高于对照组，相关性分析表明 MVD 值与 RECK 表达呈负相关说明 RECK 的表达可以抑制肿瘤血管的生成，与国外报道相似。总之，本研究表明宫颈癌组织中 RECK 的表达水平显著降低，RECK 低表达的肿瘤具有更强的侵袭和淋巴转移能力，其表达与宫颈癌 MVD 有密切关系，故二者可望成为早期诊断宫颈癌及判断预后新的指
15、标。对 RECK 基因的深入研究不但有利于更进一步了解肿瘤的生物学行为，还可以为研究抗肿瘤药物提供新的思路。【参考文献】1 Toshimichi A，Mitsuhiro T，Cheng SQ,et al.Prognostic values of matrix metalloproteinase family expression in human colorectal carcinomaJ. Surg Res，2008;146(1)：32 422 Cho CY，Wang JH，Chang HC,et al.Epigenetic inactivation of the metastasis su
16、ppressor RECK enhances invasion of human colon cancer cellsJ. Cell Physical，2007;213(1):65 9.3 Sang YS，Hee JS，Nam E,et al.Expression of reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs (RECK) as a prognostic indicator in gastric cancerJ.Eur Cancer，2006;42:101 8.4 Oh J,Takahashi R，Kondo S,et al.The membrane anchored MMP inhibitor RECK is a key regulator of extracellular matrix integrity and angiogenesisJ. Cell，2001;107:7
