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1、1HPLC 法测定乌药中异乌药内酯的含量【摘要】 目的 建立用 HPLC 法测定乌药中异乌药内酯含量的方法。方法 色谱柱为 Kromasil C18 柱(250 mm4.6 mm，5m)，流动相：甲醇-乙腈-水(35:25:40,v/v);检测波长:235nm;柱温：40;流速：1ml/min。结果 异乌药内酯的进样量在0.151.52g(r=0.9997，n=6)的范围内与峰面积呈良好的线性关系;平均回收率为98.81%，RSD 为 1.52%。结论 该法简单、可靠，可作为控制乌药药材质量的参考标准。 【关键词】 乌药;异乌药内酯;高效液相色谱法【Abstract】 Objective To
2、 establish a method for determination of isolinderalactone in Radix linderae by RP-HPLC.Methods The sample was separated on Kromasil C18 (250mm4.6mm，5m) column.The mobile phase was ethanol-acetonitrile -water (352540,v/v) at a flow rate of 1.0 ml/min and the detection wavelength was 235 nm and the c
3、olumn temperature was 40 .Results The calibration carves were linear in the range of 0.151.52g (r=0.9997,n=6).The average recoveries of isolinderalactone were 98.81% ，RSD were 1.52%.Conclusion The method is simple，accurate，reproducible and can offer referenees for the quality control of Radix linder
4、ae.【Key words】 Radix linderae; isolinderalactone; high performance liquid chromatography乌药为樟科植物乌药 Lindera aggregata(Sims)Kosterm.的干燥块根1，为常用的理气药。其现代研究多注重于生药的化学成分及药理作用的研究24，目前有关乌药含量测定的文献报道甚少5，6，而药材中异乌药内酯含量测定的方法目前尚无报道。为了更加有效地控制乌药药材质量，笔者首次建立了测定乌药中异乌药内酯的 RP- HPLC 含量测定方法，并在此基础上对不同产地的乌药药材的含量2进行了比较。1 实验材料1.
5、1 仪器 Agilent110 高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司);分析天平 DT-100(北京光学仪器厂);电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂);不锈钢电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂);KQ-600 型超声波清洗器(昆山市淀山湖检测仪器厂)。1.2 药品与试剂 异乌药内酯 上海顺勃生物工程技术(云南)公司，供含量测定用，纯度为 99.9%，200711;甲醇(色谱纯，天津市密欧化学试剂有限公司，20080129);乙腈(色谱纯，天津市密欧化学试剂开发中心，20051012);其余试剂均为分析纯，水为注射用水。乌药药材采于湖南省邵东以及安徽等地，经湖南中医药大学第一附属医院药检室鉴定为
6、樟科植物乌药 Lindera aggregata(Sims)Kosterm.的干燥块根。2 异乌药内酯的含量测定2.1 色谱条件 色谱柱为 Kromasil C18 柱(250 mm4.6mm，5m)，流动相：甲醇-乙腈-水(35:25:40,v/v);检测波长:235nm;柱温：40;流速：1ml/min。2.2 对照品的制备 精密称定异乌药内酯对照品 0.0019g,置 25ml 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(每 1ml 中含异乌药内酯 76g)2.3 样品制备 取供试品，将其粉碎成细粉，取 1g，精密称定，置 50ml 锥形瓶中，加甲醇 50ml，称重，超声 15min
7、(功率 250W，频率 20kHz)，放冷，再称定重量，3用甲醇补足减失的重量，用 0.45m 微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液，备用。2.4 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0l，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积值 Y 为纵坐标，以对照品的进样量 X(mg)为横坐标进行线性回归，回归方程为：Y=384.6900X+4.9856，r2=0.9993。结果表明异乌药内酯的进样量在 0.151.52g 的范围内与峰面积呈良好的线性关系。2.5 精密度实验 分别精密吸取对照品溶液 10l,重复进样 6 次。其异乌药内酯峰面积的
8、 RSD 为 1.88%。2.6 稳定性试验 取当日配制的供试品溶液，于 0、1、2、4、8、24h 分别进样10l，测定样品中异乌药内酯峰面积的 RSD 值为 2.30%。试验结果表明，供试液在 24h 内稳定性良好。2.7 重复性试验 取同一批供试品，按 2.3 项下方法，分别制备供试液 6 份，每份进样 10l，测定峰面积并计算含量，异乌药内酯的平均含量为 3.16mg/g，RSD值分别为 1.89%。2.8 加样回收率 称取已知含量的供试品(含 12.00%的水分，异乌药内酯含量3.16mg/g)约 0.5g 6 份，精密称定，分别置 50ml 锥形瓶中，精密加入一定量的对照品，加甲醇
9、 50ml，称重，按 2.3 项下操作，分别制得供试液，以上述色谱条件测定含量，平均回收率为 98.81%，RSD 为 1.52%。结果见表 1。表 1 异乌药内酯的加样回收率试验42.9 样品测定 取不同产地批次(分别来源于安徽，湖南邵东市售及自采)的供试品，按“2.3”项下的操作，进行测定，结果见表 2(按干燥品计算),色谱图见图 1。表 2 乌药供试品测定 3 讨论通过考察不同提取溶媒、不同提取方法、不同浸泡时间及不同提取时间对异乌药内酯提取效率的影响，最终选择甲醇作为提取溶媒;同时因为超声提取效率较高，且方法简便，所以采用该法为提取方法;考察震摇 10min、超声 15、30、60、9
10、0min，最终确定提取时间为超声 15min;考察浸泡 0、1、4、8、24h，因为差异无显著性，最终确定无需浸泡。实验先后选择了甲醇-水(4555)、乙腈-水(4555，v/v)、甲醇-乙腈-水(351540，v/v)为流动相，从分离情况和峰形等综合分析，认为甲醇-乙腈-水(351540，v/v)作为流动相条件时分离效果较为理想。 A BA 乌药供试品(sample of Radix Linderae);B 异乌药内酯对照品(isolindetalactonereference substances);1 异乌药内酯(isolindetalactone)图 1 高效液相色谱图Fig 1 HP
11、LC chromatograma本实验首次建立了异乌药内酯的含量测定方法，应用反相高效液相色谱法，以甲醇-乙腈-水作为流动相，可使乌药中的异乌药内酯较好的分离出来，该方法具有简单、稳定、可靠的特点。5【参考文献】1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:化学工业出版社,2005：53.2 谷丽华，吴纲，张紫佳，等.应用薄层色谱-生物自显影技术评价乌药等三种中药的抗氧化活性.药学学报,2006,41(10):956-962.3 Wang N,Minatoguchi S,Arai M,et al. Lindera strychnifolia is protective against
12、post-ischemic myocardial dysfunction through scavenging hydroxyl radicals and opening the mitochondrial KATP channels in isolated rat hearts. Am J Chin Med,2004,32(4):587.4 刘卫东，温中京，郭伟娣，等.乌药提取物抗疲劳作用的实验研究,浙江中医杂志，2006，41(7):428-429.5 程显隆,魏锋,冯玉飞,等.RP-HPLC 法测定乌药中乌药醚内酯和乌药内酯的含量,药物分析杂志， 2003，23(3)：225-227.6 蔡立红,俞桂新,王峥涛,等.高效液相色谱法测定乌药中乌药醚内酯的含量,中国中药杂志，2004，29(7)：657-659.
