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1、1维生素 E 对阿霉素肾毒性抑制作用的研 究作者：张慧 刁汇玲 高金祥 李清春 李宝玉 崔存德 【摘要】 目的 探讨维生素 E(vitamin E，VE)能否抑制阿霉素（doxorubicin, DXR）的肾毒性。方法 用 DXR，DXR 与 VE 处理肾小球内皮细胞（CRL 1927），通过碱性彗星实验检测 DNA 损伤程度。结果 10 mol/L DXR 处理细胞后，彗尾长度明显增加。DXR 与 VE 共同处理细胞后，彗尾长度与 DXR 处理细胞相比明显变短，并呈时间、浓度依赖性。结论 DXR 造成了肾小球内皮细胞的 DNA 损伤，而 VE 抑制了 DXR 的肾毒性作用。 【关键词】 维生
2、素 E 阿霉素 肾小球内皮细胞 【Abstract】 Objective To investigate whether vitamin E can inhibit the nephrotoxicity of doxorubicin.Methods After DXR with or without vitamin E treated renal mesangial cell (CRL 1927), alkaline comet assay was used to detect DNA damage. Results After 10 mol/L DXR treated cells, the l
3、ength of comet tails increased obviously. After DXR and VE treated cells together, the length of comet tails decreased in time and concentration dependent manner when compared to that of control group. Conclusion DXR induced the damage of renal mesangial cell , VE inhibited the nephrotoxicity of dox
4、orubicin. 【Key words】 vitamin E，doxorubicin( DXR)，renal mesangial cell 维生素 E(vitamin E，VE)又称生育酚，目前自然界有 8 种，包括 、 与 生育酚以及 、 与 生育三烯酚，其中 生育酚的生物活性最大1。VE 作为脂溶性抗氧化剂，不仅能清除自由基，还能阻断脂质过氧化，进而保护细胞和组织免受由自由基诱导的氧化损伤2,维持生物膜的正常结构3。环类抗生素阿霉素（doxorubicin，DXR），是一种具有细胞毒性的化疗药物，广泛地用于各种肿瘤的治疗。DXR 细胞毒性在杀伤肿瘤细胞的同时也导致了正常细胞组织的损伤，其
5、肾毒2性严格地限制了 DXR 的使用。故本实验以 DXR 对肾小球内皮细胞的 DNA 损伤作用为研究，探讨 VE 是否能抑制 DXR 的肾毒性。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 肾小球内皮细胞 CRL 1927 购于 ATCC。最低必需培养基(Eagles minimum essential medium ，MEM )、L 2 谷氨酰胺、小牛血清均为美国Gibco 公司产品。VE 、DXR、二甲基亚砜（DMSO）及 4，6 二脒基 2 苯基吲哚(DAPI)均购于 Sigma 公司。Olympus A70 荧光显微镜购自日本 Olympus 公司，DYY 6C 型电泳仪购自北京市六一仪器厂。
6、1. 2 细胞培养 培养液包含 DMEM、10%小牛血清、0.03% L 2 谷氨酰胺、100 U /ml 青霉素、125 mg/L 链霉素。培养箱设置为 37 、5% CO2 环境。 1.3 药物处理及细胞分组 VE 溶于 99.5%乙醇，DXR 溶于培养液。10 mol/L DXR 分别与 0.1 mmol/L，1 mmol/L VE 合用处理细胞 2 h，8 h 和 12 h。细胞分为空白组（未经药物处理），溶剂对照组（99.5%乙醇处理），阳性对照组（10 mol/L DXR 处理），10 mol/L DXR+0.1 mmol/L VE 组，10 mol/L DXR+1 mmol/L
7、VE 组。1. 4 碱性彗星实验 药物处理细胞后，离心收集，调节细胞浓度至 61010/L 。制备“三明治”凝胶：首先用 100 l 0.65%正常熔点琼脂糖，平铺在毛面载玻片上，并盖上盖玻片，置于冰上 8 min，使琼脂糖凝固；移去盖玻片，再在第一层凝胶上铺单细胞悬液(15 l 61010/L 细胞与 75 l 0.65%低熔点琼脂糖混合) ；最后在第二层凝胶上铺 75 l 0.65%低熔点琼脂糖， 第二、三制胶方法同第一层。最后，移去盖玻片，凝胶浸泡在 4 碱性裂解液(2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris base，1% sodium
8、lauryl sarcosinate，1% Triton X 100 和 10% DMSO 用前加入，pH=10 ) 中 2 h。裂解完毕转移至盛有高 pH 电泳缓冲液( 300 mmol/L NaOH, 1 mmol/L EDTA ) 中以 25 V，300 mA 电泳 20 min。DAPI 染色，荧光显微3镜观察结果。 1. 5 统计学处理 彗星实验结果应用 comet score 软件分析尾相( TM )。实验数据以 xs 表示, 采用 SPSS 12.0 软件进行单因素方差分析和 Dunnett 检验, 显著性界值采用 P 0.05。 2 结果 10 mol/L DXR 处理 CRL
9、 1 927 细胞 2、8、12 h，彗尾长度与对照组相比明显增长。特别是处理细胞 12 h 后，彗尾长度由（4.610.67）m 增为（17.561.98）m（见表 1）。DXR 与 0.1 mmol/L VE 共同处理细胞 12 h 后，彗尾的长度与 DXR组相比明显变短，但明显长于对照组；处理 2、8 h 时两组彗尾长度无明显差异。DXR 与 1 mmol/L VE 共同处理细胞 2 h 后，彗尾长度与 DXR 处理组无明显差异；处理细胞 8、12 h 后，DXR 与 1 mmol/LVE 共同处理组彗尾的长度与 DXR 组相比明显变短，但仍长于对照组，12 h 时彗尾的长度变化尤为明显
10、（见图 1）。 表 1 碱性彗星实验结果（略） 注：* 与对照组比较 P0.05 或 P0.01；与 DXR 组比较 P0.05 或P0.01 对照组 DXR 组 DXR+1 mmol/LVE 组 图 1 碱性彗星实验荧光图片（12 h）（略） 3 讨论 化疗药物 DXR 杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤了正常细胞，常可在治疗肿瘤的过程中造成组织损伤，因此其副作用限制了它在临床中的使用。因此如何提高用药安全性或者降低药物细胞毒性已经成为了医学界能否更好使用 DXR 的一大挑战。DXR 与抗氧化剂的合用为减轻 DXR 毒性的有效方法之一。但迄今为止，对 DXR4心毒性的防治研究较多，对其肾毒性的防治研究
11、少且不明确。碱性彗星实验（alkali comet assay），又称单细胞凝胶电泳 SCGE（single cell gel electrophoresis），能够检测单 SSB（single strand breaks）、双链的断裂和碱性不稳定点 ALS（alkali labile sites）4，是目前在单细胞水平上检测 DNA 微损伤的最有效方法之一。本研究主要是观察 DXR 对肾小球内皮细胞的损伤以及抗氧化药物 VE 与 DXR 合用时是否可保护细胞免受其损伤。 本研究首次发现了 DXR 可导致肾小球内皮细胞 DNA 的损伤。10 mol/L 处理 CRL 1927 细胞后，彗尾长度
12、与对照组相比明显增长。DXR 处理细胞 2 h 后，彗尾长度为（10.791.65）m，8 h 为（14.312.10 ）m ，12 h 为（17.561.98） m。因此证明了 DXR 对细胞的损伤具有一定的时间效应，可随时间的延长其毒性明显增加。其原因可能是 DXR，蒽环类细胞周期非特异性药物，促进了自由基的产生，自由基又使 DNA 的碱基和脱氧核糖发生化学变化, 引起碱基改变、破坏或脱落，以及 DNA 单链断裂（single strand breaks，SSBs ）和双链断裂(double strand breaks，DSBs)，DNA 与附近蛋白质可能形成 DNA 蛋白质交联等。 早期
13、研究报道 VE 既可优化 DXR 对肿瘤的治疗又不干扰其疗效57，同时其他研究人员也发现 VE 可加强 DXR 的毒性6或者对 DXR 的疗效无任何作用8，9。 本研究还发现用 DXR 和 VE 共同处理细胞后，其毒性作用可被消弱。DXR+0.1 mmol VE 组在处理细胞 12 h 后彗尾长度可减小到（11.011.52） m，但是在 2 h 及 8 h 与 DXR 组相比无明显变化。但是较高浓度 1 mmol VE 和 DXR 共同处理细胞时在三个时间段，彗尾长度与 DXR 相比都明显变短。这说明了 VE 抑制 DXR 的作用有一定的时间剂量效应，其原因可能是 VE 是较强的抗氧化剂，具
14、5有清除自由基的作用。 综上所述，DXR 造成了肾小球内皮细胞的 DNA 的损伤，而 VE 能抑制 DXR对细胞 DNA 的损伤作用，因此可对抗 DXR 的肾毒性。 【参考文献】 1 Halliwell B, Gutteridge JMC. Comments on review of Free Radicals in Biology and Medicine, second edition, by Barry Halliwell and John M. C. GutteridgeJ. Free Radic Biol Med，1992，12(1)：93 95. 2 Gotoh N, Noguch
15、i N, Tsuchiya J,et al. Inhibition of oxidation of low density lipoprotein by vitamin E and related compoundsJ.Free Radic Res，1996 ，24(2)： 123 134. 3 Dominguez Rodriguez JR, Gomez Contreras PC, Hernandez Flores G,et al.In vivo ihibition by antioxidants of adriamycin-induced apoptosis in murine perito
16、neal macrophagesJ. Anticancer Res，2001， 21：1869 1872. 4 Singh NP, Danner DB, Tice RR,et al. Abundant alkali sensitive sites in DNA of human and mouse sperm J .Exp Cell Res, 1989,184(2): 461 470. 5 Geetha A, Sankar R, Marar T,et al. Alpha tocopherol reduces doxorubicin induced toxicity in rats histological and biochemical evidencesJ. Ind J Physiol.Pharmacol, 1990,34:94 100. 6 Milei J, Boveri
