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1、1荆防散干预一氧化氮合酶一氧化氮通 路的抗炎机制实验研究作者：刘晓帅 曾南 梁珂 赵璐 瞿礼萍 宋美芳 张崇燕【摘要】 目的观察荆防散干预炎症模型动物一氧化氮合酶-一氧化氮（NOS/NO）通路的抗炎机制，为其功效和临床应用提供药理学依据。方法采用角叉菜胶诱导大鼠胸膜炎模型和卵白蛋白致小鼠哮喘模型，测定大鼠胸腔渗出液与小鼠肺组织匀浆中 NOS，iNOS 活力和 NO 含量的变化。结果荆防散各剂量组能不同程度地降低小鼠肺组织匀浆与大鼠胸腔渗出液中 NOS、iNOS 活力，并减少 NO 含量，其中以 5 gkg-1 剂量作用显著。结论荆防散能通过抑制 NOS 活力，尤其是与炎症反应密切相关的 iNO
2、S 活力，从而减少炎症介质 NO 的生成来发挥抗炎作用，提示干预 NOS/NO 通路是其抗炎作用机制之一。 【关键词】 荆防散； 抗炎； 一氧化氮合酶-一氧化氮通路Abstract：ObjectiveTo investigate the mechanism related to NOS/NO pathway of anti-inflammatory action of JingFang San, and to pharmacological basis for its efficiency and clinical use of treating allergic inflammation d
3、isease.MethodsInflammated animal model were carried out by the carrageenan- induced pleurisy in rats and ovabumin-induced asthma in mice. Pleurorrhea in rats and lung tissue homogenate in mice were prepared for the detection of NOS activity and NO level.ResultsCompared with model group, JingFang San
4、 at the doses of 5，2.5 and 1.25 gkg-1 could decrease the NOS activity and the NO level in inflammated area in different degree, and the suppressive effect was most significant at the dose 5gkg-1 . ConclusionJingFang San has anti-inflammatory action in two animal inflammation models, which mechanism
5、may be related to suppressing NOS activity, especially iNOS, and decrease the NO level.Key words：JingFang San； Anti-inflammation； NOS/NO pathway 荆防散由荆芥和防风两味药材组成，具有发散风寒、祛风止痒之功效，应用于2外感表证、过敏性鼻炎及过敏性皮炎等疾病的治疗。前期研究已证实荆防散具有良好的抗炎、抗过敏作用1。为进一步探讨其抗炎作用机制，本研究基于炎症性疾病发生时，一氧化氮（Nitric Oxide ，NO）生成的限速酶之一诱导型一氧化氮合酶（Indu
6、cible Nitric Oxide Synthase ，iNOS）大量生成，而由 iNOS 产生的 NO作为炎症介质广泛参与炎症、哮喘等疾病的病理发展过程的现代研究2，观察荆防散对炎症模型动物 NOS/NO 通路的影响来探讨其抗炎作用机制。1 材料与仪器1.1 药物荆防散提取液制备：按 11 比例取适量荆芥与防风（荆芥 Herba Schizonepetae，防风 Radix Saposhnikoviae，均由我校卢先明教授鉴定符合药用标准），加 10 倍量水，参照 2005 年版中国药典部附录 X“挥发油测定项”中甲法提取挥发油，挥发油另存，过滤药液，药渣按常规再煎煮 2 次，取滤液。合并
7、 3 次滤液，浓缩，醇沉（乙醇含量 60%），静置，过夜。过滤，回收乙醇。于浓缩液中加入挥发油，充分混匀，最终浓度为 1 kgL-1，4冷藏备用。参照 2005 年版中国药典部荆芥含量测定项，采用高效液相法测得荆防散中胡薄荷酮含量为 64.74 mgL-1。醋酸地塞米松片，天津太平洋制药有限公司产品，批号 060201。1.2 动物昆明种小鼠，体重 2025 g；SD 大鼠，体重 200260 g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证号分别为 scxk（川）200415、scxk（川）2004-16。1.3 试剂角叉菜胶，sigma, Lot 17H1148；一氧化氮测试盒（硝酸还原酶
8、法，批号 20070913）、NOS 测试盒（测分型，批号 20070913），南京建成生物工程研究所产品。31.4 仪器 Multiskan MK3 酶标仪，Thermolab systems；BS323S 电子天平，Sartorious；JY92-超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；980型超声雾化器，上海医械专机厂产品；SHIMAD20 SPD-10 高效液相色谱仪。2 方法2.1 荆防散对卵白蛋白致哮喘模型小鼠的影响健康昆明种小鼠，按体重随机分为 6 组，分别为对照组、模型组及荆防散大、中、小（5，2.5，1.25 gkg-1）剂量组及地塞米松组。除正常对照组腹腔注射生
9、理盐水外，其余各组均于实验第 1，7，15和 21 天分别 iP 卵白蛋白抗原液 0.2 ml（含卵白蛋白 100 g、氢氧化铝 1 mg）；实验第 28 天开始将小鼠置于钟罩内，以 50 mg/L 的卵白蛋白溶液（对照组用蒸馏水）雾化攻击，雾化速度可控且前后一致，1 次/d，30 min/次，连续 7 d。每次喷雾前 30 min，正常对照组、哮喘模型组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组分别灌胃给予相应药物。各组小鼠于末次攻击后 24 h 处死，取肺组织用生理盐水制成 10%匀浆，-75保存备用。按照试剂盒说明测定肺组织中 NOS，iNOS 活力与 NO 含量。2.2 荆防散对角叉菜胶致胸膜炎模型大鼠
10、的影响健康SD 大鼠，按体重随机分为 6 组，分组同实验“2.1”项。各组动物灌胃给药，1 次/d，连续 7 d。各组大鼠末次给药后 30 min 乙醚浅麻醉，于右胸腔注射 1%角叉菜胶 0.2 ml 致炎（对照组注射等量生理盐水）。致炎后 5 h，大鼠股动脉放血处死，打开胸腔，吸取胸腔渗出液，再用 2 ml 生理盐水冲洗胸腔，合并渗出液和冲洗液，3 000 rmin-1 离心 10 min，上清液-75 保存备用。按试剂盒说明测定胸腔渗出液 NOS，iNOS 活力与 NO 含量。3 结果43.1 荆防散对卵白蛋白致哮喘模型小鼠的影响见表 1。与对照组相比，模型组小鼠肺组织中的 NOS，iNO
11、S 活力异常升高，同时 NO 含量显著增加，提示造模成功。与模型组比较，荆防散 5，2.5，1.25 gkg-1 均能明显降低小鼠肺组织中 NO 含量（P0.05，P0.01），5，2.5 gkg-1 剂量明显抑制 iNOS 活力（P0.01，P0.05），且 5 gkg-1 剂量对总 NOS 的活力亦显著抑制（P0.01）。 表 1 荆防散对卵白蛋白致哮喘模型小鼠肺组织中 NOS，iNOS，NO 水平的影响（略）与模型组比较，*P0.05, *P0.013.2 荆防散对角叉菜胶致胸膜炎模型大鼠的影响 见表 2。与对照组比较，模型组大鼠胸腔渗出液中 NOS，iNOS 活力显著升高，NO 含量也
12、显著增加，提示造模成功。与模型组比较，荆防散 5，2.5 gkg-1 剂量能显著降低 NOS 活力（P0.01），5 gkg-1 剂量明显抑制 iNOS 活力（P0.01），且降低 NO 含量（P0.05）。表 2 荆防散对胸膜炎模型大鼠胸腔渗出液中 NOS，iNOS，NO 水平的影响（略）与模型组比较，*P0.05, *P0.014 讨论荆芥、防风均属辛温解表、祛风散寒之品。防风为“风药之润剂”，荆芥性虽温但较平和，两药相伍，相须为用，名曰“荆防散”，该药对不仅广泛用于外感表证，而且具有良好的祛风止痒之功，可用于各种与“风邪”相关的疾病，如麻疹透发不畅、风疹、湿疹等引起的皮肤瘙痒及过敏性鼻炎
13、等过敏性炎症疾病的防治。现代药理研究表明，荆芥和防风均有解热、镇痛、抗炎、抗菌、抗病毒等作用。前期研究结5果也证实，荆防挥发油、荆防散具有良好的抗炎、抗过敏作用3。为进一步探讨荆防散的抗炎作用机制，本研究采用卵白蛋白致小鼠哮喘模型及角叉菜胶致大鼠胸膜炎模型，观察药物干预 NOS/NO 通路的抗炎机制。NOS 是一种与细胞色素 P-450 还原酶相似的含铁血红蛋白酶，目前发现 NOS存在三种亚型，即内皮型（eNOS），神经型（nNOS）和诱生型（iNOS）。其中，eNOS，nNOS 又合称为原生型（cNOS），属于钙依赖性酶，在细胞处于生理状态时即有表达。其中，经 eNOS 产生的 NO 参与调
14、节血压、器官的血流分布，抑制血小板的黏附和活化，抑制多核粒细胞的聚集；而由 nNOS 产生的 NO 参与脑的发育、学习和记忆等，若产生过量则对神经有损害作用。相反，iNOS 属于非钙依赖性酶，内毒素、白介素-1、肿瘤坏死因子- 和干扰素- 均可诱导巨噬细胞等产生 iNOS，由 iNOS 催化产生的 NO 具有抗肿瘤、抗病原微生物等作用，然而 iNOS 一经诱导生成，即大量合成 NO，过量的 NO 则参与炎症、休克、哮喘等病理过程的发生发展，由此可认为 NOS（iNOS）/NO 通路与炎症的发生发展密切相关。本研究发现，角叉菜胶致胸膜炎模型大鼠的胸腔渗出液与卵白蛋白致哮喘模型小鼠肺组织中NOS，
15、iNOS 活力及 NO 含量均明显升高，与文献报道相符47；且在小鼠哮喘模型中，小鼠雾化攻击后出现烦躁、呛咳、呼吸加快、活动量下降、时间稍长即死的典型哮喘症状4。可见，两个炎症模型复制成功，荆防散对以上指标的改善作用是其抗炎机制之一。此外，实验中发现荆防散 5 gkg-1 能够显著降低两个炎症模型动物炎症区域NOS，iNOS 活力及 NO 的含量，然而荆防散 2.5 gkg-1 仅降低哮喘小鼠肺组织iNOS 活力却对总 NOS 活力无影响，降低胸膜炎模型大鼠渗出液 NOS 活力却不影响 iNOS 活力，提示荆防散对两个模型的防治作用存在一定差异。研究报道，炎6症反应过程中细胞内 Ca2+浓度升
16、高，从而使中性粒细胞发挥防御作用8，9，同时细胞内 Ca2+浓度升高又能导致 cNOS 活性提高，作者推测这是导致两个炎症动物炎症区域总 NOS 活力增加的原因之一。另一个方面，哮喘模型小鼠与胸膜炎模型大鼠比较，后者炎症区域中性粒细胞渗出尤为突出8，9，故推测渗出液中Ca2+浓度亦增加显著。荆防散 2.5 gkg-1 剂量对两个模型 NOS，iNOS 活性影响的差异，笔者认为这可能与荆防散降低胞内钙离子浓度，发挥抑制 Ca2+依赖性的cNOS 活力的作用，从而表现出其对胸膜炎模型大鼠总 NOS 活力的抑制作用强于哮喘模型小鼠。实验结果表明，荆防散的抗炎作用机制与影响 NOS/NO 炎症通路有关。其抗炎作用是否与影响花生四烯酸的代谢、影响细胞因子类炎症介质、影响钙离子的释放等有关，有待进一步深入研究。【参考文献】1 刘晓帅，曾 南，赵 璐，等. 荆防散的抗炎,抗过敏作用实验研究J.中药药理与临床，2007，23（5）：158.
