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1、1聚乙烯亚胺单独及与三种抗菌药物联用 对白念珠菌的体外抗菌活性作者：陈涛 卢婷利 张琰 傅经国【摘要】 目的 评估多支链的阳离子高分子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)单独及与三种不同类别的常规抗菌药物(两性霉素 B、氟康唑和多黏菌素 B)联合使用对白念珠菌(MY7245 和 MY7238)的两种临床分离物的抗真菌活性。方法 通过体外实验测定不同分子质量聚乙烯亚胺单独及与三种不同类别的常规抗菌药物联合使用对两株白念珠菌的最小抑菌浓度和杀灭时间，确定 PEI 单独及联合使用的体外抗真菌活性。结果 分子量在 2745ku 范围内的 PEI 均对这两种白念珠菌产生很好的抗真菌活性，且分子量小的 PEI 比分
2、子量大的 PEI 的抗菌作用更显著。与单独作用的 PEI 相比，分子量较大的 PEI 与常规药物联合使用时可产生较强的协同作用。在体外致死研究实验中可以看到，PEI-两性霉素 B 和 PEI-氟康唑结合物可以提高抑菌作用，但 PEI-多黏菌素 B 结合物却拮抗抑菌作用。结论 PEI 单独与联合使用均对白念珠菌产生很好的抗菌效果。 【关键词】 聚乙烯亚胺； 抗菌药物； 白念珠菌； 体外抗真菌活性ABSTRACT Objective To evaluate the antifungal activity of branched synthetic polymer, polyethylenimine
3、(PEI), alone and in combination with different antimicrobial agents against two clinical isolates of Candida albicans (MY7458 and MY7238).MethodsThe minimal inhibitory concentration (MIC) and time-killing rate of different sizes of polyethylanimine, alone and in combination with the drugs against tw
4、o isolates of Candida albican were investigated.ResultsIt showed that PEIs at the molecule weight range of 2 to 745 ku were all efficiently fungicidal against two C.albicans isolates. Moreover, the smaller sized of PEIs were relatively more potent than its larger molecule counterpart. In contrast to
5、 fungicidal activity of PEI alone, larger sized PEI resulted in a higher synergistic effect when combining with the 2conventional antimicrobial agents. In vitro time-killing studies, the combination of PEI-amphotericin B and PEI-fluconazole enhanced antifungal activity, but there was an antagonist f
6、or the combination of PEI-polymyxin B.ConclusionsPEI alone and in combination with amphotericin B and fluconazole displayed the high antifungal activity against Candida albicans.KEY WORDS Polyethylanimine;Antimicrobial agents;Candida albicans;In vitro anti- fungal activity近年来，全身性真菌感染类型与频率急剧上升1，2，白念珠
7、菌是最普通的真菌病原体，是形成人体中大多数局部真菌感染的主要原因35。两性霉素 B 与唑类化合物(如氟康唑、酮康唑)是目前应用最广泛的抗菌药物6，两性霉素 B 有着广谱和有效的杀真菌活性，但与唑类化合物相比却有着较大的毒性和较小的身体耐受性7。唑类抗真菌剂虽然具有较小的毒性8，但长期广泛地使用已经增加了念珠菌属对氟康唑的耐受性并且出现了一些交叉耐药性的迹象，因此迫切需要增加抗真菌药物的治疗指数，其中联合使用一些抗真菌剂使其协同地发挥作用911，是被临床证实的有效方法。研究发现，带正电荷的阳离子多肽对细菌和真菌有很强的杀灭作用，聚乙烯亚胺(PEI)是一种阳离子高分子聚合物，可作为一种体内和体外基
8、因传染和递送的载体12。我们研究了 PEI 单独使用对白念珠菌的体外抗真菌活性13，而抗菌药物与 PEI 的联合使用未见报道。本文报道 PEI 与两性霉素 B、氟康唑和多黏菌素 B联合使用来抑制白念珠菌临床分离物的体外敏感性测定。1 材料和方法1.1 材料微生物菌株 MY7245 和 MY7238 分别来自全身真菌感染的患者黏膜并经过微生物菌属鉴定为白念珠菌，菌株保存于 4的沙氏葡萄糖琼脂培养基。三种不同分子3量(745、25、2ku)的 PEI、两性霉素 B 和多黏菌素 B 硫酸盐均购自 Sigma 公司，氟康唑购自 Pfizer 公司。三种不同分子量的 PEI 均为无色或淡黄色液体，树脂含
9、量98%，5% PEI 水溶液 pH1012，使用前将其 pH 调至 7.07.2。所有样品用重蒸馏水溶解配制为浓度 10mg/L 的溶液。1.2 方法(1)抗真菌测定 体外抗真菌测定依据美国临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS，2004 年)制定的大量稀释标准进行。测试培养基采用 RPMI 1640(Gibco/BRL)，用 0.165mol/L 的三吗啉丙磺酸(MOSP)缓冲液(pH7.0)配制。PEI与两性霉素 B 配制为 RPMI 1640 培养基的 100mg/L 溶液，并逐步稀释使最终浓度范围为 1000.98mg/L。氟康唑和多黏菌素 B 配制为 RPMI 1640 培养
10、基的80mg/L 溶液，并稀释使浓度范围为 800.156mg/L。用血细胞计数操作准备浓度为 1106 细胞/ml 的接种物悬液，并稀释以获得 1104 细胞/ml 的接种量。抗真菌药物的最小抑菌浓度(MIC)定义为经 37过夜培养(1824h)后观察不到细菌生长的最小药物浓度；最小杀真菌浓度(MFC)定义为最终形成菌落数少于 25 个菌落形成单位时药物的最小浓度，表现为初始接种物的杀灭率大于 98%。(2)杀灭时间测定 生长于沙氏葡萄糖琼脂上的浓度为 1106 细胞/ml 的白念珠菌 MY7458 分离物按上述方法接种于 RPMI 1640 培养基中，并稀释获得约 1104细胞/ml 的接
11、种量。将 1ml 接种物悬液分装试管中，于 30分别培养0、3、6、24h，并逐渐稀释到所需的浓度，接种在沙氏葡萄糖琼脂培养基上于 37培养 24h 进行活菌计数测定。2 结果42.1 PEI 的抗真菌活性Tab.1 是三种不同分子量的 PEI 和常规三种不同抗菌药物两性霉素 B、氟康唑和多黏菌素 B 对白念珠菌 MY7458 和 MY7238 两种分离物的 MIC 与 MFC 值，说明 PEI 可抑制两种白念珠菌分离物的增长，同时三种不同分子量的 PEI，其抗真菌活性有一定的差异。就 MIC 值而言，745ku 与 25ku PEI 对 MY7458 的 MIC 值为 3.12mg/L，对
12、MY7238 则是 1.56mg/L，而 2kuPEI 对两种分离物的 MIC 值均为1.56mg/L。两性霉素 B 对 MY7458、MY7238 的 MIC 分别是 0.39 和 0.79mg/L，表明它的抗菌活性高于所有测试的 PEI。氟康唑对这两种分离物的 MIC 值均为1.56mg/L，而抑制同样数量的真菌则需要更高剂量的多黏菌素 B(100mg/L)。为证实 PEI 及其它抗真菌剂的杀菌活性，亦评估了 MFC。为杀灭 MY7458 需要浓度超过 50mg/L 的抗真菌药物，而杀灭 MY7238 仅需要浓度为 6.25mg/L 的 25ku PEI与 745ku PEI，但需要浓度超
13、过 50mg/L 的其他抗真菌药物。Tab.2 是 0.5 倍 MIC 的次抑菌浓度的 PEI 与三种抗菌剂联合使用时的 MIC 值，与抗菌剂单独使用时相比，联合使用的 MIC 均有所下降。两性霉素 B 的 MIC 值由不加 PEI 的 0.39mg/L 降至 0.097mg/L，而氟康唑的 MIC 值则由 1.56mg/L 降低至 0.79mg/L，但对 PMB 而言加入 PEI 不对抗菌活性产生任何效果。同时表中的数据还表明，PEI 的分子量大小不影响抗真菌剂的 MIC 值。 2.2 杀灭时间测定Fig.1 是浓度为 0.5、1、2 倍 MIC 的 25ku PEI 杀死 MY7458 的
14、动力学，纵坐标为真菌生长的对数值。图中曲线表明，与不含 PEI 的对照样品相比，所有浓度下培养 3h 之后，真菌生长减少了大约 0.5 对数生长量，6h 之后则减少约 22.5 对数生长量，且杀灭率随 PEI 浓度的增加而提高，这一增加的效果在 24h 后则更为显5著。这些结果表明 PEI 的杀菌缓慢(暴露时间)并具有浓度依赖性。2.3 PEI 联合其他抗菌药物的效果Fig.2 是两种分子量的 PEI(A：25ku，B：2ku)与两性霉素 B、氟康唑及多黏菌素 B联合抗 MY7458 的结果，每种药物的浓度为 0.5 倍 MIC 的次抑菌浓度。表明当在这三种常规抗菌药物中添加两种不同分子量1:
15、 PSB; 2: 0.5MIC; 3: 1MIC; 4: 2MICFig.1 The antifungal activity of PEI (25 ku) againstC.albicans isolate MY7458 (n=4, xs)的 PEI 时，都会使白念珠菌生存力有所下降，表明 PEI 的加入都或多或少地提高了常规抗菌药物的活性，从其作用程度比较，两性霉素 B 的促进作用最显著，氟康唑次之，多黏菌素 B 的幅度最小。从 PEI 的浓度比较，浓度较大的 PEI 更有利于常规药物抗真菌活性的提高。灭时间测定结果，表明联合抗菌药物的效果较缓慢且好于单一药物，经过 6h 的治疗可以清楚地观
16、测到真菌生长的抑制，24h 后对真菌的抑制更加显著，表明聚合药物的抗菌效果依赖于长时间的暴露。3 讨论聚乙烯亚胺(PEI)是一种广泛用于各种生物工艺过程的合成阳离子聚合物，常作为体外和体内的基因载体，研究发现它对白念珠菌具有抗真菌活性13。为探究PEI 在治疗真菌感染中可能的应用，我们在常用抗菌药物的抗真菌活性基础上，研究了不同浓度 PEI 的抗菌效果。与氟康唑相比，在低浓度时 PEI 抑制白念珠菌分离物的生长，其活性强于多黏菌素 B，但弱于两性霉素 B。同时 MFC 测定获得6的结果也表明，利用更高浓度抗真菌剂稀释的标准液体培养基，极少能观察到完全抑制真菌的生长，但分子量为 25 和 745ku 的 PEI 对 MY7238 分离物的抑制则是例外。PEI 与其他抗真菌剂的 MIC 和 MFC 的区别，表明这些抗真菌剂和 PEI在膜上的作用靶点并不类似，因此需要进一步的研究以确定 PEI 与膜之间的相互作用机制。研究结果表明 PEI 浓度较高时对两性霉素 B 的活性有重要的促
