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1、1高速逆流色谱法制备岩黄连中的脂溶性 生物碱刘朝亮 1，程轩轩【摘要】 目的采用高速逆流色谱法对岩黄连中的脂溶性生物碱进行制备分离。方法经过筛选确定溶剂系统为正己烷 醋酸乙酯 甲醇 水(3755;1.551.55)、正己烷 醋酸乙酯 甲醇 0.2 mol/L 盐酸(13.52.54.5)，上相作固定相，下相作流动相，转速 860 r/min，流速 1.2 ml/min。结果经连续 3 次高速逆流色谱分离，可直接从岩黄连的醋酸乙酯粗提物(300 mg)中得到 4 个纯度较高的脂溶性生物碱，经过与对照品比较保留时间及质谱鉴别，确定产物为 Cheilanthifoline(12.3 mg，纯度：76
2、.1%)、Thalictrifoline(3.6 mg，纯度：83.1%)、Tetrahydropalmatine(13.7 mg，纯度：85.5%)、Canadine(8.7 mg，纯度：78.5%)。结论采用高速逆流色谱法制备分离岩黄连中的脂溶性生物碱，快速、简便、产物得率和纯度较高。 【关键词】 高速逆流色谱; 岩黄连; 生物碱岩黄连系罂粟科紫堇属多年生草本植物石生黄堇 Corydalis saxicola Bunting 的全草。作为黔桂高寒山区的特效草药，长期以来岩黄连一直被广泛应用于治疗热毒痈疮、急性腹痛、急性黄疸型肝炎等症。经过系统分离方法，我们已经确定岩黄连的主要成分为生物碱1
3、。鉴于其中的化合物结构相似，制备纯化过程耗时长、溶剂消耗大，化合物得率低，本研究采用高速逆流色谱法探索岩黄连中生物碱的快速制备方法。高速逆流色谱法(high-speed countercourrent chromatography, HSCCC)是在 202世纪 80 年代由美国 Yoichiro Ito 教授首先研究和发展起来的一种现代色谱分离制备技术2。HSCCC 不使用固相载体作固定相，克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点3，可在短时间内实现高效分离和制备。 据报道，HSCCC 制备分离生物碱的经典溶剂系统为氯仿 甲醇体系;考虑到该溶剂对仪器的损耗，本研究根据溶剂平衡
4、时间、化合物分配系数等参数对多组溶剂系统进行筛选，建立了快速制备分离岩黄连中脂溶性生物碱的 HSCCC 方法。1 材料与仪器1.1 试剂及药品色谱纯试剂：乙腈(Tedia Company，Fairfield，USA)分析纯试剂：正己烷，醋酸乙酯，甲醇，盐酸(天津市红岩化学试剂厂)。对照品：Cheilanthifoline，Thalictrifoline，Tetrahydropalmatine，Canadine 为实验室自制(HPLC 检测纯度95%)。1.2 仪器 QuilPrepTM Chassis MK V 500/Series II HPLC Pump 高速逆流色谱仪(英国/AECS 美
5、国 SSI)，配有四组不锈钢线圈(110 ml42 mm)和 5 ml 定量环;Waters Fraction Collector III 自动流分收集器;Waters 600E 型高效液相色谱仪, Waters 996 二极管阵列检测器。Thermo LCQ DECA XP 高效液相色谱-质谱联用仪(ESI-MS);JY 98- 超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技有限公司)。2 方法2.1 供试品的制备 取适量岩黄连药材粉碎过 60 目筛，用 6 倍量 95%乙醇超声提取 3 次，过滤，合并滤液浓缩后混悬于水中，用醋酸乙酯萃取 3 次，合并萃取液，回收溶剂，干燥后得提取物备用。32.2 HS
6、CCC 溶剂系统选择每次称取醋酸乙酯萃取物约 4 mg 置于试管中，分别取上相、下相溶液各 2 ml 溶解样品，充分振荡溶解。待两相平衡后，分别取上相、下相溶液，挥干，再用甲醇溶解，进行 HPLC 分析。计算不同溶剂系统中，目标化合物的分配系数 K 值和两相溶剂系统的“平衡时间”：即当上相与下相溶剂混合时，两相系统达到完全分层的时间，该参数与固定相的保留率密切相关。K=目标化合物在上相溶液中的峰面积值 A1 目标化合物在下相深液中的峰面积值 A2 表 1 不同溶剂系统的平衡时间及主要化合物在溶剂中的 K 值溶剂系统组成比例2.3 HSCCC 制备分离将溶剂系统置分液漏斗中，混匀，静置过夜，分成
7、固定相(上层)和流动相(下层)。使用前超声 30 min。称取醋酸乙酯萃取物 300 mg，用 5 ml的下相溶液溶解，作为 HSCCC 的样品，备用。首先将固定相(上相)泵入高速逆流色谱仪，待线圈内充满固定相后，调转速至 860 r/min。然后将流动相泵入色谱仪，待流动相从管柱出口流出，基线稳定，即达到平衡时，将 5 ml 样品(300 mg/5 ml)溶液注入高速逆流色谱仪。流速为 1.2 ml/min，转速为 860 r/min。紫外检测器，检测波长为 270 nm。流份由自动接收器收集。进样 110 min 后，停止主机转动，用氮气将固定相推出，测得保留率均大于 80%。 3 结果本
8、实验中，曾先后对溶剂系统：正己烷 甲醇 水、正己烷 醋酸乙酯 甲醇 水、正己烷 醋酸乙酯 甲醇 盐酸、石油醚 醋酸乙酯 水、石油醚 醋酸乙酯 甲醇 水等进行了筛选。以两相溶液的平衡时间以及目标化合物的分配系数为参数，并结合固定相的保留率，最终确定醋酸乙酯萃取物的 HSCCC 溶剂系统，如4表 1 所示。按照表 1 中的溶剂体系，先后对醋酸乙酯萃取物(见图 1)进行 3 次 HSCCC 制备分离，分离得到的流份进行 HPLC 分析，将化学组成相同的流份合并后，浓、缩干燥，收集其中纯度较高的 4 段组分(见图 1：ad)。经过质谱鉴别及与对照品比较保留时间，确定 4 组生物碱分别为：a: Chei
9、lanthifoline，ESI-MS: m/z 326 M+H+(12.3mg，纯度：76.1%);b: Thalictrifoline，ESI-MS: m/z 354 M+H+(3.6mg，纯度：83.1%);c: Tetrahydropalmatine，ESI-MS: m/z 356 M+H+ (13.7mg，纯度：85.5%);d: Canadine，ESI-MS: m/z 340 M+H+(8.7mg，纯度：78.5%)。 a.Cheilanthifoline b.Thalictrifoline c.Tetrahydropalmatine d.Canadine 图 1 岩黄连醋酸乙酯
10、萃取物和HSCCC 分离产物的 HPLC 图谱4 讨论采用高速逆流色谱法制备分离岩黄连中的生物碱的研究未见文献报道。笔者在前期研究中，采用系统分离方法对岩黄连的醋酸乙酯萃取物部分进行多次柱层析，脂溶性生物碱的得率仅为 0.1%左右。本文通过优选溶剂系统，经 3 次 HSCCC分离可从醋酸乙酯粗提物中直接获得较高纯度的生物碱化合物，且产物得率较高(约 1.2%4.6%)。与传统的柱层析分离方法相比，高速逆流色谱法耗时短、步骤简单、节约溶剂，避免了多次反复柱层析造成的样品损失，而且流动相的选择范围较宽，在短时间内可以实现高效分离和制备。【参考文献】1 Xuanxuan Cheng, Dongmei Wang，Lin Jiang，et al.DNA Topoisomerase I Inhibitory Alkaloids from Corydalis saxicolaJ.Chemistry Biodiversity，2008，5 (7): 1335.2 曹学丽.高速逆流色谱分离技术及应用M.北京：化学工业出版社，2005：16.53 张天佑.逆流色谱技术M.北京：科学技术出版社，1991：267.
