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1、1苦参碱诱导人肝癌细胞株 HpG2.2.15 凋 亡的实验研究【摘要】 目的研究苦参碱诱导人肝癌细胞株 HpG2.2.15 的凋亡机制。方法使用MTT 法测定细胞生长率，流式细胞仪检测细胞凋亡和 Fas 蛋白的表达，RT-PCR检测 Fas 基因的表达。结果苦参碱对人肝癌细胞株 HpG2.2.15 的生长抑制率为75.5%。苦参碱具有诱导 HpG2.2.15 细胞凋亡的作用，诱导细胞凋亡率为 57.9%。苦参碱诱导人肝癌细胞株 HpG2.2.15Fas 基因的表达率（4.11%）优于对照组DDP（3.7%）。苦参碱可使细胞株的 Fas 蛋白表达增加。结论苦参碱具有诱导HpG2.2.15 细胞凋
2、亡的作用，其作用是促进 Fas 基因的表达，使 Fas 蛋白增加。 【关键词】 HpG2.2.15 细胞株； 苦参碱 ； 凋亡； 凋亡蛋白乙肝病毒与肝癌发生密切相关，两者相关率高达 80，在肝细胞癌中，血清HBV 阳性感染率为 94.78；HBsAg 阳性携带率为 89.571。HBV-DNA 与肝细胞 DNA 紧密结合在一起，乙肝病毒产生的 X 蛋白在肝癌的发生和发展中起着重要的作用。苦参碱可诱导人肝癌细胞株 HpG2 凋亡，应用全基因组表达谱芯片检测差异表达基因，苦参碱可改变人肝癌细胞株 HpG2 细胞基因谱，调控凋亡基因的表达，在苦参碱治疗的 C6 细胞株中，57 个基因表达上升 2 倍
3、，而 11 个基因至少下调 2 倍2，3。苦参碱可诱导 wp53 的表达，从而激活 Bax 基因，抑制 Bc1-2 基因；并且 wp53 还可能诱导 Fas 的表达，最终导致细胞凋亡4。苦参碱促进HpG2 细胞 Bax 的表达，抑制 Bcl-XL 和 Bcl-2 蛋白的表达，说明苦参碱可通过抑制 HepG2 细胞内 Bcl-2/Bcl-XL 的活性，减少细胞色素 C 的释放，激活 caspase-3蛋白进而激活 caspases 蛋白酶家族，诱导细胞凋亡的发生5。2HpG2.2.15 细胞株是将乙肝病毒 X 基因转染到 HpG2 细胞株内所得，更符合中国人乙肝诱发原发性肝癌的发病特点。本实验研
4、究苦参碱对人 HpG2.2.15 细胞株的作用。1 材料1.1 细胞株人 HpG2.2.15 细胞株，由本实验室保存。在含 10胎牛血清的DMEM 培养液中，37，5CO2 条件下培养。1.2 试剂苦参碱注射液 5 ml50 mg，江苏吴中医药集团有限公司，批号070604。MTT 和 G418 购自 sigma 公司，胰蛋白酶和 Fas 抗体购于 sigma 公司。DAB 试剂盒购自天津灏洋生物公司，ABC-Kit 试剂盒购自 sigma 公司。兔抗人HBxAg 多克隆抗体（HBx99 rabbit pdycolonal AB serum，Rabbit 2）由本实验室保存。1.3 仪器酶标仪
5、（美国 Bio-Rad 公司 680）， BD FACSCanto 流式细胞仪，电泳仪(美国 Bio-Rad 公司)，紫外透射仪(美国 Bio-Rad 公司)。2 方法分为治疗组、对照组和空白组。对照组采用顺铂。2.1 MTT 实验法MTT 用 PBS 配制成 5 mg/ml。细胞悬液以 104/孔接种于 96 孔培养板（200 l/孔），治疗组每孔加入苦参碱 10l（200 g/ml），对照组DDP10 l（20 g/ml），空白组加入培养液 10 l/孔。在 37，5%CO2 的培养箱中培养 24 h。每孔加入 MTT20 l，每次 3 孔，37作用 4 h。吸弃各孔中的上清，每孔加入 D
6、MSO 150 l，振荡，紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在波长 540 nm处测定吸光度 A 值。上述试验重复 4 次。32.2 流式细胞学检测法对数生长期的细胞，胰酶消化后，以 5104/ml 的密度接种，贴壁后加入 DMEM 培养基培养 24 h，治疗组加入苦参碱 10 l（200 g/ml），对照组加入顺铂 10 l（20 g/ml），空白组加入等体积的培养液。继续培养 48 h，胰酶消化成单细胞悬液，冰 PBS 洗涤 2 次，800 r/min 离心 5 min，弃上清，缓慢加入-20预冷的 70%乙醇，4过夜。取细胞悬液，PBS 洗涤，1 600 r/min离心 5 min 后，弃上清
7、。PI 染液 1.0 ml 染 30 min，混合液经过 300 目滤网以除去杂质，620 nm 检测。每样本收集多于 10 000 个荧光信号。在流式细胞仪上作Fas 基因表达分析。将细胞培养后直接将细胞送至流式细胞室做检查。2.3 RT-PCR 试验方法2.3.1 引物序列 Fas-F5-TCCTACCTCTGGTTCTTAC-3Fas-R5- CTCTTCACTTCCTCTTTGC-3Beta-actin F5- ACTCTTCCAGCCTTCCTT-3 Beta- actin R5- ACTCGTCATACTCCTGCT-32.3.2 逆转录过程（RT）试剂：5AMV buffer R
8、NA 酶抑制剂 随机引物 DNTPs AMV RT 反应体系 20 l 灭菌的 DEPC 水 10.3 l5AMV buffer4 lRNA 抑制剂0.4 lOligo(DT) 1 ldNITs1.3 lRAN2 lAMV 1 l2.3.3 反应条件 3790 min，9510 min，4pause。PCR 反应体系 25 l dH2O14 l10PCR Buffer2.5 ldNTPs1.2 lPrimer11.2 lPrimer21.2 lTemplate4 lTaq 酶 0.8 l2.3.4 PCR 反应程序 954 min 9540 s 5430 s 7230 s 725 min 4
9、pause 3 结果3.1 苦参碱抑制 HpG2.2.15 细胞增殖（MTT）的实验结果 细胞生长抑制率的4计算公式为：细胞生长抑制率（%）=实验组 OD 值/ 对照组 OD 值100。以生长抑制率的结果大于 50%有效。DDP 的细胞生长抑制率 86%，苦参碱的细胞生长抑制率为 75.5%，低于 DDP 的抑制率，但是高于 50%的有效标准，苦参碱对人肝癌HpG2.2.15 细胞株有抑制增殖的作用。结果见图 1。从图 2 中可看出，顺铂和苦参碱组的吸光度值随着时间的延长而减少，细胞数量逐渐减少，顺铂和苦参碱具有诱导人肝癌 HpG2.2.15 细胞株凋亡的作用。3.2 细胞凋亡细胞凋亡的实验结
10、果见图 3。经 2 检验，2=8.00，P= 0.000，按 a=0.05 水准，各组诱导细胞凋亡有差别。苦参碱诱导细胞凋亡率为 57.9%。结果见图 4。3.3 苦参碱对 Fas 蛋白的影响诱导 Fas 蛋白的表达。见图 5。经 2 检验， 2=1.41，P= 0.000，按 a=0.05 水准，在诱导 Fas 基因表达具有统计学意义。苦参碱诱导 Fas 基因的表达率（4.11%）要优于 DDP（3.7%）。见图 6。3.4 苦参碱对 Fas 基因的影响 Fas 表达产物是 495bp，HpG2.2.15 细胞株 Fas基因表达较弱，HpG2 有明显 Fas 基因表达。苦参碱可以诱导 HpG
11、2.2.15 细胞株的 Fas 基因表达，其作用要低于内毒素。结果见图 78。4 讨论肝细胞凋亡抑制与肝癌以及胆管癌的发生和发展具有密切的关系，在肝纤维化中也具有重要的作用6。诱导肿瘤细胞凋亡和正常分化是恶性肿瘤治疗的主要目标，Fas/FasL 是细胞凋亡的主要机制。5通过 MTT 实验，苦参碱可以显著减少细胞生长的数量，虽没有顺铂组抑制率高，但是也超过有效的标准。细胞抑制率与苦参碱的浓度密切相关，浓度越高，抑制率越显著。在流式细胞仪测定细胞凋亡的实验中，可以看到苦参碱有显著的凋亡峰值，随着时间延长，细胞凋亡数量明显增加，而细胞凋亡主要阻滞于 G1 期。这说明苦参碱具有诱导人肝癌 HpG2.2
12、.15 细胞株凋亡的作用。细胞凋亡主要与 Fas 基因的表达密切相关，用流式细胞仪测定 Fas 蛋白的表达，可以看到 Fas 蛋白表达的数量与时间密切相关，随着时间延长，表达 Fas 蛋白的细胞数量增加，苦参碱诱导 Fas 蛋白表达的数量要高于顺铂。使用 RT-PCR 的方法检测 Fas 基因，苦参碱有促进 Fas 基因表达的作用。苦参碱具有诱导 HpG2.2.15细胞的 Fas 基因表达，使 Fas 蛋白增加，从而诱导细胞凋亡。研究表明，苦参碱有抑制胃溃疡形成的作用，可减少胃酸的分泌7，具有抑制肝细胞的 PDGF 和 TGF-beta1 的活性，从而具有抗肝纤维化的作用8，可通过减少血管兴奋
13、蛋白磷酸化而抑制 PKA 的活性，从而减少 Hela 细胞的黏附和转移9，具有抑制 K-562 细胞株增殖和诱导分化的作用，64.6%细胞阻滞在 G1 期10。苦参碱具有抗恶液质的作用，可能是抑制了白细胞介素-6 和 TNF-a 的作用11。HBx 蛋白可使乙肝病毒的复制加快12，使肝癌细胞对细胞毒药物的具有抵抗性。研究表明，苦参碱具有诱导人肝癌 HpG2.2.15 细胞株凋亡的作用，其作用机制是促进 Fas 基因的表达，使 Fas 蛋白增加。【参考文献】1阮秀花，田 葱，张效本，等.肝癌患者乙型肝炎病毒感染血清流行病学分6析J.现代中西医结合杂志，2007，16（14）：2031.2Zhan
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