内.外毒素知识介绍

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1、内毒素知识介绍内毒素知识介绍细菌与细菌内毒素的概念 细菌内毒素，英文称作 Enolotoxin，是 G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂 A细菌内毒素这个概念在 1890 年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933 年 Boivin 最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到 1940 年时候，Morgan 使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了 1950 年以后，随着生物学，物理化学，免疫

2、学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。细菌英文叫 Bacteria：为原核生物中的一类单细胞微生物由二分裂法繁殖。若按革兰氏染色法可将细菌分为 G+菌和 G-菌两大类。这两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。唯有肽聚糖为其共同成分，但其含量的多少和肽链的性质有所不同，见下表：细胞壁结构革蓝氏阳性菌革蓝氏阴性菌厚度厚，1550薄，1015肽聚糖含量多，占胞壁干重 5080%少，占胞壁干重 10%左右脂类含量少，约 14%多，约 1122%磷壁酸有无外膜无有脂蛋白无有脂多糖无有关于细菌细胞壁结构，尤其 G+/G-菌不同之处见

3、下图所示：由以上结构模式图可以发现，G+菌与 G-菌有不同之处，其中对于 G-菌来说： 细胞壁较薄，厚约 1015nm，结构也较复杂。肽聚糖含量低，仅占细胞干生 10左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。（1）脂蛋白（lipoprotein） 由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上，另一端由共价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸 残基上，使外膜和肽聚糖层构成一个整体。 （2）外膜（outer membrane） 是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，位于肽聚糖

4、的外侧，其结构类似细胞膜，为液态的磷脂双层，其中镶嵌一些特异蛋白质，穿透外膜的内外双层，呈液态镶嵌体。外膜中间有微小孔道，容许水溶性的小分子通过，以进行细胞内外的物质运输和交换。除此之外，外膜还能防止胰蛋白酶和溶菌酶等进入，起到保护性屏障作用。（3）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS） 由多糖 O 抗原、核心多糖和类脂 A(lipid A)组成（图 1-8），位于最外层。多糖 O 抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴性菌的菌体抗原（O 抗原），有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonic acid,

5、 KDO）等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂 A 是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。细菌内毒素即：许多病原性细菌所产生的毒素。一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。加一类为内毒素（Endotoxin）。是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒

6、性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A 成分。细菌外毒素与内毒素性质的比较细菌外毒素与内毒素性质的比较 外毒素（外毒素（ExotoxinExotoxin）内毒素（内毒素（ExotoxinExotoxin）几乎无发热性很强的发热性细菌的代谢产物细菌外壁层上的特有结构细胞破裂后游离出来毒性作用强毒性作用比较弱很强的免疫原性，制成抗毒素能中和抗原毒素抗原性弱单纯蛋白质，易被分解破坏核酸多糖的高分子聚合物，不易被分解破坏对热不稳定，无透析性耐热性，无透析性福尔马林可使其转化为类毒素福尔马林不能使毒性消失对肿瘤细胞几乎无影响破坏肿瘤细胞白喉毒素，肉毒毒素，破伤风毒素厌氧菌毒素，溶血性链球菌毒素等大肠

7、菌，霍乱绿脓菌，沙门氏菌，赤痢菌等（1）外毒素（exotoxin） 有些细菌在其生命活动过程中产生毒素能释放到周围环境中，称为外毒素。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。如痢疾杆菌、霍乱弧菌等。细菌外毒素有以下特点：毒性强，如纯化肉毒杆菌外毒素结晶 1mg 可杀死 2,000 万只小白鼠，对人的最小致死量约为 10-4mg，破伤风毒素对小白鼠的致死量为 10-6mg，白喉毒素对豚鼠的致死量为 10-3mg。对机体组织有选择性的毒性，如白喉杆菌外毒素主要抑制蛋白质合成，特别是影响肽链延长，引发心肌炎、肾上腺出血及神经麻痹等；破

8、伤风外毒素主要毒害脊髓前角运动神经细胞，引起所属肌肉的痉挛强直。 具有抗原性，外毒素的化学成分为蛋白质，有抗原性，即以外毒素刺激机体可产生大量的抗毒素，抗毒素能中和外毒素使其无毒。外毒素用甲醛处理后，脱毒变成类毒素，但仍保持抗原性。 （2）内毒素（exotoxin） 是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性。内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂 A 成分。 内毒素的致病作用无特异性，即各种革兰氏阴性菌对人类引起基本相同的反应。少量内毒素可引起机体发热反应；大量内毒素进入血液，可使血管透性改变，局部出血，颗粒性白细胞增多或减少和体

9、重下降，严惩毒时能导致内毒素性休克。内毒素毒性比外毒素小得多。 内毒素是外源性致热原，它可能激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。细菌内毒素化学结构及化学组份细菌内毒素化学结构及化学组份到目前为止，我们知道细菌内毒素作为 G菌细胞壁外表层结构的一部分脂多糖（lipopolysacch aride,LPS）主要是由多糖 O 抗原，核心多糖和类脂 A(Lipid A)三部分组成。见图所示： 类脂 A 位于最多层。多糖抗原向外由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，具有特异性，核心多糖分为内核心及外核心，外核心由数种已糖，包括葡萄糖，半乳糖，乙酰氨基葡萄糖等组成。内

10、核心含有庚糖及特殊的 KDO (3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖)。KDO 以不耐酸的酮糖键与类脂 A 的氨基葡萄糖连接。所有 G-菌都有此结构。类脂 A 是以脂化的葡萄糖胺二糖为单位。通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物。具有致热作用。是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分细菌内毒素生物活性细菌内毒素生物活性类脂 A 作为内毒素生物活性的主要部分。也是近年来研究报道最多的。由氨基葡萄糖，磷酸，10-18 碳的长链脂肪酸组成，它与可溶性的 O-特异性链及核心分离后。即有难溶于水的特性。游离后的类脂 A。可自身凝聚成高分子的复合体，其分子量大小不等。同时它也含有疏水性的中心及亲水性的边沿。是一种双相分

11、子，又是酸碱两性分子，因此类脂 A的独特结构使细菌内毒素具有多种的生物活性。细菌内毒素不同水平上的生物活性细菌内毒素不同水平上的生物活性A.机体水平 发热性 致死毒性 体重减少 Shwartzman 反应 骨髓反应（bone marrow reaction） 白血球减少（lEUcopenia） 血小板减少（thrombocytopenia） B.细胞水平 巨噬细胞的活性化（TNF,IL-1.IL-6产生） 阻止巨噬细胞游走 淋巴球 olony formation stimulation 前列腺素的产生 抗肿瘤坏死作用 C.分子水平 补体活化性 非特异的感染防御（nonspecific resi

12、tance） 耐受性（tolerant） 辅药作用（adjuvant） 寒颤（血压低下，血管内凝固）Hageman 因子活化性 纤维蛋白溶酶原活性化 鲎细胞溶解物凝集细菌内毒素的耐热性细菌内毒素的耐热性我们知道细菌内毒素除了具有各种生物活性外，还具很强的耐热性，一般的高压灭菌不能使其灭活，需 25030 分钟以上的干热灭菌才能使其灭活，目前我国药典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃用具的灭菌处理为 1802 小时或 25030 分钟以上，而日本药局方第十三改正为 2501 小时以上。其它各国药典也大都如此，据国外文献报导，当对细菌内毒素的稀水溶液，在不同温度下保温处理后进行检测，发现其内毒

13、素活性在 2001 小时时还能检测出来。而只有当加热到 2501 小时才能完全灭活，国内细菌内毒素标准品的耐热情况虽然未能考察，但可以认为对细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采用 2501 小时以上的干烤处理。 细菌内毒素的除去方法细菌内毒素的除去方法由于细菌内毒素具有很强的耐热性，因此对于它的去除采用一般的灭菌方法是无法达到的，尤其是制药行业注射剂中内毒素的除去，对于临床用药的安全性意义重大，因此对于药品中内毒素去除可以使用过滤及高压灭菌方法，而对于一般水溶液，则普通采用薄膜过滤后高压法，对于实验中所用器具可使用干热或射线给予灭活，其它也可使用酸、碱破坏的方法。对于细菌内毒素检查法中所用

14、实验用具的外源性内毒素除去方法，最好采用 2502hr 以上的干热灭菌方法。 各种外界因素对细菌内毒素活性的影响各种外界因素对细菌内毒素活性的影响细菌内毒素的生物活性随外界因素的影响变化很大。目前已经知道。一些金属离子、超声波以及温度等都会对细菌内毒素的生物活性产生很大影响，据国外文献报导，铁离子、铝离子和镓离子等会引起细菌内毒素活性的降低。因此在试验过程中最好使用玻璃用具，以必免这些因素，另外温度的高低对细菌内毒素水溶液活性影响很大，根据国内外文献的报道：内毒素水溶液活性随着环境温度的升高而降低，因此对于内毒素水溶液一定要在低温处保存，而且对已经稀释好的内毒素水溶液，要尽可能的在 2 小时内

15、用完。以免活性降低。细菌内毒素致病机理细菌内毒素致病机理（1）致热性内毒素可使人体和动物致热，人体对内毒素致热原敏感。在正常情况下，人体内内毒素的正常阈值保持在 0.001-0.05ng/ml 之间，一旦人体免疫力下降或遭受某种致病菌侵袭时，细菌便在机体内繁殖崩解，释放出大量的内毒素，当体内内毒素的浓度高于这个阈值时，即可启动内外源致热原引起机体发热。（2）内毒素对糖代谢的影响及其机理内毒素直接或间接损害肝脏，引起糖代谢紊乱及酶学、蛋白代谢的改变。致病机理：脂多糖能刺激肾上腺素的分泌和释放，使磷酸环化酶活性增强，加速糖分解，使血糖浓度表现为暂时性升高。低血糖症的主要机理：脂多糖进入机体数小时后

16、，始作用于肝细胞，引起肝细胞的损伤，使糖元异生的关键酶活性降低，抑制糖原的异生和分解，激活丙酮酸激酶，加速葡萄糖的分解氧化，并产生大量的热量，在临床上表现为发烧症或持续低血糖症。内毒素致肝脏枯否氏细胞功能受到抑制，进而影响对内毒素的消除及对胰岛素的分解代谢。（3）内毒素对血液循环系统的影响及机理：内毒素可引起白细胞和血小板减少，激活凝血、纤溶系统，产生出血倾向，可导致弥漫性血管内凝血（DIC）的发生。DIC 严重时，可导致严重的休克症状。内毒素（脂多糖）对中性粒细胞的作用及机理：内毒素（脂多糖）能引起人体血液中中性粒细胞的增多，这是人体对内毒素反应最敏感的指标之一，亚致热量即可引起中性粒细胞的减少，并伴之以粘连性增加，数小时后，中性粒细胞明显增多。脂多糖对血小板的影响：对实验动物注射足量的脂多糖后，均能导致动物血液中血小板明显减少。脂多糖对淋巴细胞的作用：脂多糖作用于 B 淋巴细胞，可增强 B 淋巴细胞 DNA 的合成。脂多糖能提高人体体液免疫功能，革兰氏阴性菌感染后引发的机