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1、 6VP-2F02-2北京康辰北京康辰药业药业有限公司公司有限公司公司无菌无菌检查检查方法学方法学验证资验证资料料文件起草：文件起草： 日期：日期： 文件文件审审核：核： 日期：日期： 文件批准：文件批准： 日期：日期： 6VP-2F02-2无菌检验方法学验证 第 1 页 共 17 页1.方法概述及方案说明1.1 方法概述：无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检查条件下未发现微生物污染。我公司无菌检查法采用薄膜过滤法，通过供试品对每一试验菌抑菌活性的检查，并于阳性对照比较，如含供试品各容器中的
2、试验菌生长良好，并和阳性对照容器内的培养结果相似，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用消除，供试品可按该法进行无菌检查。若含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。应选择无抑菌作用或抑菌作用消除的检验条件作为供试品的无菌检查方法。1.2 确认目的依据 2010 版中华人民共和国药典对注射用尖吻蝮蛇血凝酶的无菌检验方法进行再验证，确认该方法适合于该产品的无菌检查，并确认合适的检验条件，以保证无菌检查方法的科学性和检验结果的准确性。1.3 方案实施的条件1.3.1 验证所需检测仪器 验证所需主要检测仪器及设备表仪器设备要求生化培养
3、箱完好且校验合格电脑恒温培养箱完好且校验合格1.3.2 相关文件：确定验证依据验证依据表6VP-2F02-2无菌检验方法学验证 第 2 页 共 17 页名称要求药品生产质量管理规范（2010 年修订）化学工业出版社中国药典（2010 年版二部）2.菌种及培养基来源确认2.1 菌种来源菌种名称菌种代码菌种来源金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003枯草芽胞杆菌CMCC(B)63501铜绿假单胞菌CMCC(B)10104白色念珠菌CMCC(B)98001中国生物制品检验所2.2 培养基来源 ：中国生物制品检验所3.培养基灵敏度验证3.1 培养基灵敏度验证：为证明硫乙醇酸盐流体培养基、营养肉汤、改良马
4、丁培养基适合于细菌，真菌的无菌检查，对硫乙醇酸盐流体培养基、营养肉汤、改良马丁培养基灵敏度检查。3.2.参照标准：2010 版中国药典二部附录 XI H 无菌检查法。3.3.试验材料：3.3.1. 被验证培养基：品名：硫乙醇酸盐流体培养基 规格： 250g/瓶 批号： 090827 生产厂家：北京三药科技开发公司 品名：改良马丁培养基 规格： 250g/瓶 批号： 090605 生产厂家：北京三药科技开发公司 3.3.2. 仪器设备：3.3.2.1.压力蒸汽灭菌器 6VP-2F02-2无菌检验方法学验证 第 3 页 共 17 页3.3.2.2.净化工作台 3.3.2.3.电热鼓风干燥箱 3.3
5、.2.3.3.生化培养箱 (2328)3.3.2.3.4.恒温培养箱(3035)3.3.3. 稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液3.3.3.3. 验证用培养基：3.4.菌液制备：3.4.1.取经培养 1824 小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤新鲜培养物 1ml 加入到 9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10 倍稀释至小于 100cfuml 的菌悬液备用。3.4.2.取经培养 2448 小时的白色念珠菌的改良马丁培养物 1ml 加入到 9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10 倍稀释至小于 100cfuml 的菌悬液备用。3.5.菌液计数：（每种菌液接种 2 个平皿）分别取上
6、述制备的金黄色葡萄糖球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌各 1ml 加入培养皿，每种菌液平行做 2 皿，注入不超过 45营养琼脂培养基 1520ml，置 3035培养箱培养二天，取上项制备的白色念珠菌菌液 1ml 加入培养皿，平行做 2 皿，注入不超过45的玫瑰红钠琼脂培养基约 1520ml，置 2328培养箱培养三天。3.6.无菌培养基的无菌性检查3.6.1 培养基的配制名称生产厂家批号营养琼脂培养基北京三药科技开发公司100506玫瑰红钠琼脂培养基北京三药科技开发公司0806116VP-2F02-2无菌检验方法学验证 第 4 页 共 17 页硫乙醇酸盐流体培养基的配制：取硫乙醇酸盐流体培养基
7、29.25g，加 1L 蒸馏水，加热煮沸使其完全溶解，摇匀分装到试管中，每只试管装量 12ml。 营养肉汤培养基的配制：取硫乙醇酸盐流体培养基 18g，加 1L 蒸馏水，加热搅拌使其完全溶解，摇匀分装到试管中，每只试管装量 12ml。改良马丁培养基的配制：取改良马丁培养基 28.5g，加 1L 蒸馏水，加热搅拌使其完全溶解，摇匀分装到到试管中，每只试管装量 9ml。3.6.2 培养基的培养硫乙醇酸盐流体培养基和营养肉汤培养基置于 3035的培养箱中培养 14 天；改良马丁培养基置于 2328的培养箱中培养 14 天，每天观察培养基浑浊情况。将结果填写于培养基无菌性检查记录中。3.7.培养基灵敏
8、度检查3.7.1.硫乙醇酸盐流体培养基等灵敏度检查至少应进行 3 次独立的平行试验。3.7.2 培养基的配制硫乙醇酸盐流体培养基的配制：取硫乙醇酸盐流体培养基 29.25g，加 1L 蒸馏水，加热煮沸使其完全溶解，摇匀分装到试管中，每只试管装量 12ml。 营养肉汤培养基的配制：取硫乙醇酸盐流体培养基 18g，加 1L 蒸馏水，加热搅拌使其完全溶解，摇匀分装到试管中，每只试管装量 12ml。改良马丁培养基的配制：取改良马丁培养基 28.5g，加 1L 蒸馏水，加热搅拌使其完全溶解，摇匀分装到到试管中，每只试管装量 9ml。3.7.3.培养基接种取每管装量为 12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基 9
9、 支，分别接种小于 100cfu/ml 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌 2 支，另 1 支不接种作为空白对照，培养 3 天；取每管装量为 9ml 的改良马丁培养基 5 支，分别接种小于 100cfu/ml 的白色念珠菌、黑曲6VP-2F02-2无菌检验方法学验证 第 5 页 共 17 页霉各 2 支，另 1 支不接种作为空白对照，培养 5 天。逐日观察结果。3.7.3.3.结果判断空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。将结果填写于附表 2 培养基灵敏度检查表中。4.无菌检验方法验证4.1 试验要求：连续做 3 次。4.2 培养基制备及菌液
10、接种：4.2.1 制备金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、白色念珠菌等 4 种对照菌液，取流乙醇酸盐流体培养基 12g，加水 400ml,加热煮沸使溶解，分装至 7 支试管中，每支50ml。用牛皮纸包裹捆好后，121灭菌 20 分钟。取改良马丁培养基 5.8g，加水 200ml,加热煮沸使溶解。分装至 3 只试管中，每支 50ml.用牛皮纸包裹捆好后，121灭菌 20 分钟。在流乙醇酸盐流体培养基中金黄色葡萄球菌菌液/铜绿假单胞菌菌液/枯草芽胞杆菌菌液各 1 支，每支接种量 1ml(含菌小于 100cfu)，另一只不接种作为空白对照。改良马丁培养基中接种白色念珠菌菌液 1 支，每支接种
11、量 1ml(含菌小于 100cfu)，另一支不接种作为空白对照。4.2.2 供试液制备：取本品 20 瓶，每瓶加灭菌注射用水 1ml，摇匀。用注射器吸取所有供试品溶液，注入一 0.45m 薄膜过滤器中，过滤。用 0.9%氯化钠缓冲液冲洗滤膜 3 次，每次100ml。取出滤膜，等分成 3 份，分别加入 1 支装有 50ml 硫乙醇酸盐流体培养基的试管和1 支装有 50ml 改良马丁培养基的试管中，培养。4.2.3 阳性对照：3 支装有不同菌液 50ml 流乙醇酸盐流体培养基的试管，1 支装有白色念珠菌菌液 50ml 改良马丁培养基的试管。阳性对照液的制备：取金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 00
12、3新鲜斜面培养物 1 白金耳，接种至营养肉汤培养基内，3035培养 1824 小时，用 0.9无菌氯化钠溶液制成 1ml 含 10100cfu 的菌液。6VP-2F02-2无菌检验方法学验证 第 6 页 共 17 页4.2.4 阴性对照：用薄膜过滤器，0.45m 水系膜过滤，过滤氯化钠-蛋白胨缓冲液 100ml，然后取出，分别接种至空白流乙醇酸盐培养基和空白改良马丁培养基中，分别给以相应条件培养。4.3 操作方法（薄膜操作方法（薄膜过滤过滤法）法）4.3.1.操作前准备：各试验器具等，去除牛皮纸外包装，放入传递窗中。供试品、培养基管用 75%乙醇棉球擦拭外表面后，放入传递窗中。开启超净工作台的
13、风机及紫外灯；开启操作间的风机并提前进行臭氧消毒 2 小时。操作人员洗手液清洗双手，再用 75%乙醇棉球擦拭双手后，换无菌服进入无菌室。4.3.2 薄膜过滤法操作：将试验器具、样品及培养基由传递窗移入超净工作台，开启样品的塑料件，并过火焰 3 次。用灭菌镊取出注射器，在火焰旁安装上针头，并将针头迅速通过火焰 3 次。取规定量的供试品，用注射器吸取 1 ml 的稀释剂使供试品复溶，再用注射器吸取全部复溶后的溶液，注入薄膜过滤器中，滤过。取规定 20 瓶供试品，用注射器直接吸取全部供试品溶液注入薄膜过滤器中，滤过。用稀释剂冲洗滤膜，每次 100ml，共冲洗 3 次。如确认供试品没有任何抑菌性，可不
14、用冲洗。用无菌镊取出滤膜，置空培养皿中，用无菌剪刀将滤膜分成三份，分别放入装有 50ml 硫乙醇酸盐流体培养基的 2 支试管和装有50ml 改良马丁培养基的 1 支试管中。在上述 1 支硫乙醇酸盐流体培养基中，接种 1ml 阳性对照液，作为阳性对照。将一定体积（复溶所用稀释液的体积）的稀释液注入另一薄膜过滤器中，滤过。用稀释液冲洗滤膜，每次 100ml，共冲洗 3 次。用无菌镊取出滤膜，置空培养皿中，用无菌剪刀将滤膜分成两份，分别放入装有 50ml 硫乙醇酸盐流体培养基的 1 支试管和装有 50ml 改良马丁培养基的 1 支试管中，作为阴性对照。另取改良马丁培养基、硫乙醇酸盐流体培养基各 1 管，直接培养，作为本底对照。6VP-2F02-2无菌检验方法学验证 第 7 页 共 17 页4.3.3 培养培养硫乙醇酸盐流体培养基管置 3035培
