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1、蓝莓的组织培养与快速繁殖技术研究摘要摘要：利用蓝莓的茎段或茎尖为材料，在 MS 和 MPS 培养基上添加相应组合比例的激素，快速繁殖蓝莓植株体。同时探索蓝莓离体繁殖影响因素，筛选蓝莓离体所需最佳启动、增殖和生根的培养基及培养条件。1 立题依据1.1 研究的目的筛选出适宜蓝莓外植体的培养条件等影响因素。 进一步探索不同的激素对蓝莓外植体组织培养、所育苗质量的影响及生根情况，探索最适合蓝莓外植体组织培养的激素组合及比例。总结其组培培养的应用技术，为今后蓝莓的育种工作及基因工程技术奠定基础。1.2 研究的意义蓝莓果实皮薄、风味酸甜可口,具有独特的保健功能。蓝莓果实中含有较多的花色素苷、黄酮等生理活性
2、成分,能有效防止脑神经衰老、糖尿病等疾病的发生,增强心脏功能,而且在明目及抗癌等方面也具有独特功效。联合国粮农组织将其列为人类五大健康食品。蓝莓作为一种具有良好保健功效的水果,是 21 世纪具有良好发展前景的果树品种之一。蓝莓所含的花青甙类色素具有色泽艳丽、加工稳定性高的特性,是迄今已被利用的最佳天然色素之一,被广泛用于药物或高级美容用品的生产。在美国,蓝莓被誉为“21 世纪功能性保健浆果” 、 “水果中的皇后”和“世界第三代水果” 。蓝莓鲜果和加工品在欧洲等经济发达国家市场上深得销售者喜爱，虽然价格昂贵但仍供不应求。一些专家学者开展了对其组织培养体系的研究，以期产业化快速培育蓝莓种苗。因此研
3、究其高效繁殖有重要的价值及意义。2 国内外研究进展目前，我国种植的蓝莓在生产上通常采用组织培养和扦插相结合的育苗扩繁方法。应用组培方法扩繁速度快，适宜于优良品种的快速扩繁。吉林农业大学于 1983 年率先在我国开展了蓝莓引种栽培工作，到 1997 年，从美国、加拿大、芬兰、德国引入抗寒、丰产的蓝莓优良品种 70 余个，其中包括兔眼蓝莓、高丛蓝莓、半高丛蓝莓、矮丛蓝莓、红豆越橘和蔓越橘六大类型。1989 年，蓝莓组培育苗获得成功，采用组培脱毒技术对所选优良品种快速扩繁，并解决了蓝莓组织培养工厂化育苗扩繁技术后，在长白山建立了 5 个蓝莓引种栽培基地。1995 年，初步选出 4 个适宜长白山区栽培
4、的蓝莓优良品种，并开始推广种植。在兔眼蓝莓研究上，南京植物研究所于 1988 年从美国引入 12 个优良品种，并在南京和栗水两地试栽成功。1999 年，日本环球贸易公司与吉林农业大学李亚东教授达成合作协议，由日方投入资金，中方投入技术，在山东青岛组织蓝莓产业化生产，开创了我国蓝莓产业开发与跨国公司合作的先河，至 2005 年，山东青岛蓝莓基地于 2001 年定植的苗木进入丰产期。与此同时，李亚东教授通过自建和技术支持等方式在辽宁、吉林相继建立了以公司为主体的蓝莓产业生产基地。在南方，南京植物研究所贺善安、於虹等教授通过技术支持，先后在浙江、贵州等地建立了上万亩兔眼蓝莓生产基地。吉林农业大学、浙
5、江省农业科学院园艺研究所等单位，在成功建立蓝莓组培快繁技术的基础上，正在建立蓝莓扦插和种子繁殖技术体系。硬枝扦插主要适合于高丛蓝莓和矮丛蓝莓，而绿枝扦插主要适合于兔眼蓝莓、矮丛蓝莓和高丛蓝莓中硬枝扦插生根困难的品种。总体来看，国内组培育苗技术及扦插技术已经比较成熟，但缺少自主培育的品种，多为引进品种。北美地区的美国和加拿大是蓝莓技术研究最早、技术力量最强的国家。到目前为止，美国全国有 30 多个大学和科研院所进行蓝莓研究，研究内容主要集中在优良品种选育、丰产栽培技术、安全生产技术和果实采后处理与加工技术等方面。美国在品种选育研究上已先行一步，选育出了适宜美国南北各州、各种气候条件的优良品种 1
6、00 多个。继美国之后，加拿大、欧洲的波兰和德国、南美洲的智利和阿根廷、澳大利亚、日本、前苏联等 20 多个国家先后开展了蓝莓的引种、育种及种植工作。东欧的波兰华沙农业大学和波兰科学院果树研究所是欧洲境内从事蓝莓研究的主要科研单位，他们根据波兰的气候条件，以提高抗寒能力和果实品质为目标，从 20 世纪 60 年代开始，进行蓝莓的杂交育种和品种选育工作，选育出了果实大、品质佳、抗寒力强的优良品种。美国关于蓝莓离体繁殖已有大量报道。我国学者在组织培养蓝莓研究中表明，宜选用蓝莓的茎段或茎尖为外植体，最佳培养基为改良 WPM。组织培养兔眼蓝莓较好的激素组合是 6-BA5.0mg/L+ZT1.0mg/L
7、+NAA0.2mg/L 或 6-BA5.0mg/L+ZT2.0mg/L+NAA0.3mg/L。组织培养高丛蓝莓和矮丛蓝莓，在改良WPM 培养基中加 ZT0.52.0mg/L 可显著促进外植体增殖。据研究证明，蓝莓在试管内生根慢、生根率低，故采用试管外生根,方法是将试管苗幼枝基部培养基洗净,用 1000,2000,3000mg/LBA 溶液速蘸(1s)处理,扦插于腐熟的苔藓基质上,扣小拱棚置温室内,冬季棚温控制在 1525,夏季不越过 28,20d 即可生根。其他外植体培养中，Hrlsko D 等研究者 1993 年从蓝莓的实生苗上获取子叶和上胚轴作 为外植体诱导不定芽获得成功，把蓝莓的根作为外
8、植体诱导植株再生尚在研究探索阶段。Chem ik 等人进行上胚轴诱导不定芽试验，研究表明以真叶器官诱导偶尔获得不定芽。Sidorovich 等对种子和胚诱导不定芽尚未成功。相比之下，众多研究者以蓝莓叶片诱导不定芽获得成功的几率较多大。利用高丛蓝莓和兔眼蓝莓的叶片诱导出不定芽均有获得成功的报道。矮丛蓝莓以子叶或胚可诱导生成愈伤组织进而长出不定芽。当以老叶为外植体进行诱导不定芽时，萌动率高于用幼叶时。在以叶片为外植体研究过程中 Sharon 以无菌苗的叶片诱导增殖时，在 WPM 培养基中添加 10-15mol/mL 2ip，经 4 周培养后，获得70一 100叶片不定芽的再生。Rowland 于
9、1994 年探讨了蓝莓叶片再生体系中激素浓度的配比对再生的影响，结果表明添加 20mol/mL ZT 的处理是加人15mol /mL 2ip 的处理不定芽分化率 6 倍之多。孙阳以改良 WPM 为基本培养基研究不同浓度的玉米素(ZT)对 3 个蓝莓品种叶片离体再生分化率及生根速度的影响，结果表明。ZT 浓度在 0.15 mg/L 时对蓝莓叶片离体再生效果最佳,IBA 对蓝莓叶片离体再生能力影响较小。最适宜叶片诱导再生培养基配方为改良WPM+ZT0.15mg/L+IBA 001m g/L,最高叶片分化率为 61.蓝莓叶片培养的适宜方法:取继代培养 35 d 左右的组培苗,将叶片剪掉叶梗和叶尖，剪
10、成 1cm 的方块接种于改良 W PM 培养基上 ， 先在黑暗条件下培养 12 周,然后移至光下培养 2 周进行继代培养。 3 研究方法3.1 已有条件蓝莓植株体材料，灭菌、培养等所需设施。3.2 准备采用方法实验采用的培养基是在 MS 和 WPS 基础上改良的 WPM 培养基分别加入不同质量浓度的 6-BA 和 NAA，制成改良的 WPM 培养基。从中选择最适合幼芽诱导分化、增殖生根的培养基。培养基 pH4.05.0 在 121、131kpa 的条件下灭菌 20min。培养温度(242)，光照 1012h/d，光照强度为 12001600lx。3.3 技术路线蓝莓外植体选择 外植体灭菌接种激
11、素配比及浓度调节 初步培养基配置及灭菌 初代培养 接种 激素+继代培养基配置 继代培养接种激素+生根培养基配置 生根培养4 设计方案4.1 外植体的选择有试验证明:带叶柄的叶片出芽率更高，此外，蓝莓的外植体材料还可以选择剪去茎段两端多余部分后的中间部分。所以，选长势旺盛的幼嫩枝条，除去所有叶片，切取除顶芽外的第 310 节茎段作外植体。4.2 外植体的灭菌切取 3cm 带顶芽的幼嫩茎段去叶片留叶柄，用清水洗干净，75%酒精浸泡30s，0.1 升汞溶液消毒 78min,无菌水冲洗 45 次,用滤纸吸去水分，将茎段切成 12 个腋芽的小段。4.3 初代培养 外植体的初代培养所用基本培养基：WPM
12、+蔗糖+琼脂+激素,其中蔗糖浓度为 2 % 3 % ,琼脂为 0.60 % 0.65 %, 各种激素浓度范围 6- BA 0. 5 5. 0 mg/L, NAA0 . 05 0. 30mg/L 等。综合培养条件为 pH 值 5.0,121高温灭菌 20min,培养温度(25),空气相对湿度为 60%左右,光照强度 1500lx, 11 h/d。4.4 继代培养 将丛生芽切割 2cm 左右茎段，每瓶接种 45 节，转入继代增殖培养基中继代增殖培养，3 个月后观察实验情况，再进行继代增殖培养。4.5 生根培养 在继代增殖培养基中生长的苗，一部分用以继续增殖，另外转入生根培养基进行生根培养。取 2c
13、m 长的新梢接种到生根培养基上,接种后首先黑暗处理20 天，然后转到光照下培养，3040 天可以移栽。生根培养基 1/2WPM + NAA0.15 mg/ L。5 预计研究成果5.1 预计工作量 本次实验预计所需时间半年，具体安排如下：5.1.1 第一个月，利用大约一周时间，查找相关资料及确定最终实施流程；第二周，准备初步实验所需器材，采集新鲜蓝莓植株体的叶子，要求带叶柄，先进行少许的灭菌及初步探索接种，为后续大量实验时总结经验及教训；在后续时间中，观察初代培养基上的生长情况，进行大量实验准备实验：外植体的筛选及灭菌，培养基的配置、激素的配比及浓度调节等；5.1.2 第二、三个月，根据第一个月
14、探索的情况，按流程进行实验。初代培养基配置及激素的调节，灭菌及接种，初代培养基上的外植体一周后可能开始萌发，愈伤组织诱导形成芽，68 周后长成所预计的新梢。5.1.3 将初代培养基上的新生枝转接到继代增殖培养基上，二至三个月可能离体茎段发生的不定芽增殖、分化，一般每 3 个月继代一次。再转接到生根培养基上培养，二个月后不等将会生根。5.2 预期结果经过几个月的实验，能够在瓶内生根培养基上观察到由蓝莓外植体快速繁殖出的蓝莓植株。根据查阅文献，以蓝莓幼嫩的茎段为外植体 ,其启动培养基和增殖培养基最佳配方均为 MW + NAA0. 05 mg /L+6-BA 0.5 mg /L,适合生根的培养基为1
15、/2MW +NAA 0.15 mg/L。参考文献1 Line Brissette, Laurence Tremblay, Danitel Lord. Micropopagation of lowbush blueberry from mature field-grown plants J.Hortscience,1990,25(3):349-351.2 Wolfe DE, Eck P, Hin C. Evaluation of seven media for micropropaga-Tion of highbush blueberry J.Hort Science, 1983, 18(6):
16、703-705.3 Kader F. Rovel B. Fractionation and identification of the phenolic compounds of highbush blueberries (Vaccinium Corymbosum L. J.Food Chemistry,1996,55(1):35-40.4ARENAME,MARTINEZPGJ.AdventitiousshootinductionfromleafexplantsofRibesmagellanicumculturedinvitroJ.ScientiaHorticulturae,1997,72:73-75 李守萍,张德财.浅谈浆果类树种在辽宁省果业发展中的地位J.辽宁农业科学,2003(1):37-38.6 刘树英，张志东。兔眼越桔芽增生诱导培养基及激素的筛选J
