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1、第八讲第八讲 植物营养研究的现代技术概况植物营养研究的现代技术概况植物营养研究的传统方法植物营养研究的传统方法 生物模拟生物模拟 化学分析化学分析 核素技术核素技术 数理统计数理统计传统研究方法难以解决的问题举例传统研究方法难以解决的问题举例细胞水平养分互作机制细胞水平养分互作机制-磷磷- -锌、硅锌、硅- -盐、盐、 钙钙- -重金属重金属养分的非维管束吸收机理养分的非维管束吸收机理-荚果、果实荚果、果实养分的确切功能及与细胞结构的关系养分的确切功能及与细胞结构的关系细胞区隔化与酶促反应定位及与养分转化关系细胞区隔化与酶促反应定位及与养分转化关系控制植物营养性状基因的克隆、表达与转基因控制植
2、物营养性状基因的克隆、表达与转基因细胞生物学细胞生物学运用近代物理、化学技术和分子运用近代物理、化学技术和分子 生物学概念，研究生命尤其是细胞生物学概念，研究生命尤其是细胞 活动的科学。活动的科学。大大深化对生命本质的认识大大深化对生命本质的认识可供借鉴的细胞和生物学方法可供借鉴的细胞和生物学方法 亚细胞组分分级分离技术亚细胞组分分级分离技术 电子显微镜技术电子显微镜技术 电子探针分析技术电子探针分析技术 显微放射自显影技术显微放射自显影技术 跨膜电位测定技术跨膜电位测定技术 细胞化学成分测定技术细胞化学成分测定技术 抑制剂的选择抑制剂的选择 分子筛技术分子筛技术 细胞培养技术细胞培养技术 基
3、因工程技术基因工程技术1 1 亚细胞组分分级分离技术亚细胞组分分级分离技术 亚细胞水平植物养分吸收和运转机亚细胞水平植物养分吸收和运转机理研究的必要前提理研究的必要前提 采用机械或化学方法破坏细胞，使采用机械或化学方法破坏细胞，使之在稀释剂中形成匀浆之在稀释剂中形成匀浆 根据细胞组分大小和沉降特性进行根据细胞组分大小和沉降特性进行离心获得目标细胞组分离心获得目标细胞组分 借助有关手段对目标细胞组分研究借助有关手段对目标细胞组分研究2 电子显微镜技术 透射电镜主要用于超薄切片中亚细胞透射电镜主要用于超薄切片中亚细胞水平内部结构及养分状况观察水平内部结构及养分状况观察 扫描电镜适于组织、细胞的外部
4、形态扫描电镜适于组织、细胞的外部形态及表面细微结构的研究及表面细微结构的研究 二者均可与电子探针配合使用二者均可与电子探针配合使用 原子粒显微镜原子粒显微镜3 3 电子探针分析技术电子探针分析技术利用高能电子束轰击试样表面的微小区利用高能电子束轰击试样表面的微小区 域得到的特征信号，通过检测发射出的域得到的特征信号，通过检测发射出的 X X射线波长射线波长( (或能量或能量) )和强度，确定该和强度，确定该 微区内所含元素的种类和含量微区内所含元素的种类和含量可定性检测的元素种类为可定性检测的元素种类为5 5B B至至9292U U，可定，可定 量分析原子序数在量分析原子序数在NaNa以后的元
5、素以后的元素电子探针分析表明，缺硫导致油菜叶片、电子探针分析表明，缺硫导致油菜叶片、 花粉和柱头细胞硫分布显著降低。花粉和柱头细胞硫分布显著降低。正常（正常（A,C） 与与 缺缺 硫（硫（B,D ）油油 菜菜 叶叶 片片 、花、花 粉粉 和和 柱柱 头头 细细 胞胞 的的 电电 子子 探探 针针 能能 谱谱 图图电子探针在分析作物叶片细胞（微区）电子探针在分析作物叶片细胞（微区） 中元素的含量中元素的含量电子探针微区扫描技术可以很好的将叶肉细胞内元素电子探针微区扫描技术可以很好的将叶肉细胞内元素 种类和元素含量测定出来。快速、有效！种类和元素含量测定出来。快速、有效！利用扫描电镜观察，利用扫描
6、电镜观察，EDAX-9100能谱仪作为电子探针对能谱仪作为电子探针对 叶肉细胞中元素含量进行分析，其分析元素范围为叶肉细胞中元素含量进行分析，其分析元素范围为5B92U ，检测极限为，检测极限为0.1%电子探针在分析作物叶片细胞（微区）电子探针在分析作物叶片细胞（微区） 中元素的含量中元素的含量4 4 显微放射自显影显微放射自显影- -液体闪烁测定液体闪烁测定利用放射性同位素产生的射线，使照相乳胶卤化利用放射性同位素产生的射线，使照相乳胶卤化 银晶体感光，经显影把感光的卤化银还原成黑银银晶体感光，经显影把感光的卤化银还原成黑银 粒。这些感光银粒的存在部位和黑度指示出示踪粒。这些感光银粒的存在部
7、位和黑度指示出示踪 物存在的部位与数量。常用的同位素有物存在的部位与数量。常用的同位素有3 3H H、1414C C、 3232P P、3535S S、4545CaCa、6565ZnZn等。等。 应用液体闪烁技术可对亚细胞组分示踪物含量应用液体闪烁技术可对亚细胞组分示踪物含量 作定量精确测定。作定量精确测定。采用采用4545CaCa显微放射自显影显微放射自显影 等研究，提出了花生荚果等研究，提出了花生荚果 钙的钙的CaCa2+2+是通过主动吸收是通过主动吸收 由胞外进入胞质中，并以由胞外进入胞质中，并以 共质体途径在组织及细胞共质体途径在组织及细胞 间运输。间运输。5 5 跨膜电位测定技术跨膜
8、电位测定技术 利用专一性微电极测定植物细胞液泡利用专一性微电极测定植物细胞液泡 内部和外部溶液的电位差，并与能斯内部和外部溶液的电位差，并与能斯 特方程计算结果比较，判断该养分跨特方程计算结果比较，判断该养分跨 膜运动是否为一主动过程。膜运动是否为一主动过程。 通常在显微镜下在显微操作台上将玻通常在显微镜下在显微操作台上将玻璃电极插到液泡中测量。璃电极插到液泡中测量。显微吸收光度术细胞不同化学成 份染色具有不同的吸收波长，且吸 收值与细胞化学含量间存在化学剂 量关系，适用于养分胁迫下植物碳 氮代射特点的研究，其可测定的物 质有蛋白质、核酸、精氨酸、多糖 和糖元等6 细胞化学成分测定技术显微荧光
9、探针术显微荧光探针术利用特定荧光指示剂对细胞特利用特定荧光指示剂对细胞特 定组分定组分(Ca(Ca2+2+、核酸和蛋白质等、核酸和蛋白质等) )的高度特异亲和的高度特异亲和 力和高荧光量子效率，通过测定荧光强度或荧光力和高荧光量子效率，通过测定荧光强度或荧光 激发光谱偏移或发射光谱偏移，确定组分浓度。激发光谱偏移或发射光谱偏移，确定组分浓度。可连续准确测定细胞内核酸、蛋白质及可连续准确测定细胞内核酸、蛋白质及CaCa2+2+浓浓 度，而且能直观地提供钙在细胞内分布及流动等度，而且能直观地提供钙在细胞内分布及流动等 重要代谢信息。重要代谢信息。低效B高效B低效B高效B电泳技术电泳技术由于某种酶各
10、同工酶之间氨基由于某种酶各同工酶之间氨基 酸序列不同，胁迫条件下酸序列不同，胁迫条件下mRNAmRNA表达量不同，表达量不同， 在一定在一定pHpH的缓冲液中所携带的电荷、荷质及的缓冲液中所携带的电荷、荷质及 分子形状也不同。电泳时，各同工酶和分子形状也不同。电泳时，各同工酶和mRNAmRNA 电泳速率差异使之可以彼此分开。电泳速率差异使之可以彼此分开。该方法对于植物营养遗传特性和分子生理研该方法对于植物营养遗传特性和分子生理研 究有重要意义。究有重要意义。7 抑制剂的选择 核酸与蛋白质合成抑制剂核酸与蛋白质合成抑制剂 膜功能抑制剂膜功能抑制剂 线粒体和叶绿体功能抑制剂线粒体和叶绿体功能抑制剂
11、 其他过程抑制剂如钙离子运输等其他过程抑制剂如钙离子运输等8 分子筛技术(凝胶过滤技术) 在一定凝胶介质（孔径）中，不同在一定凝胶介质（孔径）中，不同分子量大小的物质流速不一样，根分子量大小的物质流速不一样，根据不同时间的流出组分即可把不同据不同时间的流出组分即可把不同分子量大小的物质分离开分子量大小的物质分离开9 细胞培养技术 在无菌条件下将植物细胞从机体分离出来，在无菌条件下将植物细胞从机体分离出来， 在模拟体内环境条件下，让其生存和生长，在模拟体内环境条件下，让其生存和生长， 该技术是植物营养遗传的细胞学工程的基础该技术是植物营养遗传的细胞学工程的基础 。它包括愈伤组织培养、单细胞培养及
12、多细。它包括愈伤组织培养、单细胞培养及多细 胞悬浮培养等胞悬浮培养等10 基因工程技术（分子操作）（分子操作） 属分子生物学范畴，均为细胞生物学方法属分子生物学范畴，均为细胞生物学方法 ，是植物营养遗传特性改良的希望之路。，是植物营养遗传特性改良的希望之路。 包括选择目的基因；在细胞体外将载体包括选择目的基因；在细胞体外将载体( (细细 菌质粒菌质粒) )与目的基因结合成重组与目的基因结合成重组DNADNA分子；将分子；将 重组重组DNADNA分子引入受体细胞，使外源基因得以分子引入受体细胞，使外源基因得以 表达。表达。原位动态测定原位动态测定Nuclear Magnetic Resonanc
13、e (NMR) CT核磁共振分析技术是利用物理原理，通过对核磁共核磁共振分析技术是利用物理原理，通过对核磁共振谱线特征参数的测定来分析物质的分子结构与性质振谱线特征参数的测定来分析物质的分子结构与性质它不破坏被测样品的内部结构，是一种无损检测方法在它不破坏被测样品的内部结构，是一种无损检测方法在化学、生命科学中有广泛的应用。化学、生命科学中有广泛的应用。核磁共振技术及其应用核磁共振技术及其应用11 Electrophysiological techniques1234567Experimental arrangement for leaf cell measurementsNitrate (m
14、M)05101520i (nA)-180-120-600-100 mV-140 mV-180 mVBA Vm (mV)-200-160-120-80-40i (nA)-180-120-6001 mM5 mM7 mM15 mM20 mMICP-MSLA- ICP-MSGC-MSHPLC-MS-Bycombiningthecapabilitiesofadvancedsample preparationmethodologieswiththelatestgenerationof secondary ion mass spectrometry instrumentation, we show that
15、 chemical information on the distribution ofeven dilute species in biological samples can be obtained with spatial resolutions of better than 100nm. Here,we show the distribution of nickel and other elements in leaf tissue of the nickel hyperaccumulator plant Alyssum lesbiacum prepared by high-press
16、ure freezing and freeze substitution.Reflectance optical micrographs of a resin-embedded cross section of nickel-rich Alyssum lesbiacum leaf prepared by high- pressure freezing, followed by freeze substitution, showing a high level of tissue preservation.（a）NanoSIMS maps from a peripheral region of the leaf cross section, including a stomatal complex obtained using the Cs+ primary ion beam, and showing 16O-, 12C2-, 12C14N-,
