《5、 相对定量： δδct法和相对标准曲线法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《5、 相对定量： δδct法和相对标准曲线法（41页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Module 5 相对定量：相对定量：CT法和相对标准曲线法法和相对标准曲线法 2 相对定量相对定量 PCR: 相对基因表达量相对基因表达量 3 目的基因：Plat 1 未处理 样本 处理后 样本 示例实验示例实验 问题:样本处理后，目的基因的表达量有什么变化? 4 DRn Cycles Ct =23 Ct = 24 DCt = 24 23 = 1 未处理组：目的基因 处理组：目的基因 目的基因与目的基因与目的基因目的基因的比较的比较 5 DRn Cycles 未处理组：目的基因和内参基因 处理组：目的基因和内参基因 如果加入如果加入内参基因内参基因会怎样呢会怎样呢? ? DCt = 23 1
2、3 = 10 Ct = 24 Ct =14 Ct = 13 Ct = 23 DCt = 24 14 = 10 6 两种相对定量的方法两种相对定量的方法 比较 Ct (Ct) 法 相对标准曲线法 样本间的倍数关系样本间的倍数关系 7 两种方法的区别两种方法的区别? ? 已知各个基因的扩增效率 不需要每次都做标准曲线 简单, 经济, 通量较高 每个基因都要做一条标准曲线 准确的扩增效率计算 工作量大, 成本高, 通量较低 比较 Ct (Ct) 法 相对标准曲线法 8 如何选择相对定量的方法？如何选择相对定量的方法？ Template Ct 目的基因 内参基因 A B C D E F G H I J
3、 对应点相减 A-F = Ct1 9 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 6/7/2013 Template Ct 目的基因 内参基因 A B C D E F G H I J 对应点相减对应点相减 如何选择相对定量的方法？如何选择相对定量的方法？ A-F = Ct1 B-G = Ct2 C-H = Ct3 D-I = Ct4 E-J = Ct5 10 在在ExcelExcel中制作图表中制作图表 Ct1 Ct2 Ct3 Ct4 Ct5 A-F = Ct1 B-G = Ct2 C-H = Ct3 D-I = Ct4 E-J = Ct5
4、 Ct 稀释点 1 2 3 4 5 如何选择相对定量的方法？如何选择相对定量的方法？ 11 根据斜率选择一种定量方法根据斜率选择一种定量方法 比较 Ct (Ct )法 斜率 0.1 相对标准曲线法 斜率 0.1 如何选择相对定量的方法？如何选择相对定量的方法？ 12 Ct 法法 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 6/7/2013 13 Ct 法的必要条件法的必要条件 两个基因 (目的基因和内参基因) 必须有 相一致的扩增效率，并尽可能接近 100% ! 14 | Life Technologies Proprietary & Co
5、nfidential | 6/7/2013 Ct法如何确认扩增效率法如何确认扩增效率 每对引物一条标准曲线 15 标准曲线可以帮助判断扩增效率标准曲线可以帮助判断扩增效率 斜率 -3.3 说明扩增效率接近 100%. 公式: E = 10(-1/斜率) -1 16 Ct法如何判断扩增效率一致法如何判断扩增效率一致 同时扩增目的基因和内参基因， 通过 查看扩增曲线中指数增长期是否平行来确 定扩增效率是否相似。 17 检查指数增长期的曲线之间是否平行检查指数增长期的曲线之间是否平行 内参基因 目的基因 19 后续实验中采用Ct 法. 21 Ct反应板设置反应板设置 对未知样本的目的基因和内参基因进
6、行定量 (每个样本三个重复) 无模板对照 (NTCs) 污染监测 22 Ct法结果计算法结果计算 步骤步骤 2: 其他其他样本样本和和对照样本对照样本比较比较 DCt 处理样本 DCt 对照样本 = DDDDCt 步骤步骤 1: 内参基因内参基因均一化样本差异均一化样本差异 Ct 目的基因 Ct 内参基因= D DCt 步骤步骤 3: 使用公式计算使用公式计算 2-DDDDCt 倍数变化倍数变化 = 23 为什么为什么Ct值要相减而不是相除值要相减而不是相除? ? Ct 值是指数值, 而不是线性值. 因此, 我们不能直接用 Ct值相除. 用相减来比较Ct值. (例如: 225 220 = 25
7、) 24 公式含义公式含义? ? 2 CT 2 =循环间扩增产物量的倍数变化 (i.e.PCR扩增产物 量倍增) DDDD CT =校正过的处理样本和校正过的对照样本之间的循 环数差异 所以，这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间 目的基因的倍数变化目的基因的倍数变化 25 Ct计算示例计算示例 Untreated Treated 2 Treated 1 Cttarg. Ctnorm. dCt ddCt 2(-ddCt) 26.1 16.7 9.4 0 1 23.8 16.0 7.8 -1.6 3 22.8 17.7 5.1 -4.3 20 显示出两倍的表达差异. 重复样本平均Ct值 26 U
8、ntreated Treated 2 Treated 1 Cttarg. Ctnorm. dCt ddCt 2(-ddCt) 26.1 16.7 9.4 0 1 23.8 16.0 7.8 -1.6 3 22.8 17.7 5.1 -4.3 20 为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理 Ct计算示例计算示例 Ct 目的基因 Ct 内参基因= Ct 27 Untreated Treated 2 Treated 1 Cttarg. Ctnorm. Ct ddCt 2(-ddCt) 26.1 16.7 9.4 0 1 23.8 16.0 7.8 -1.6 3 22.8 17.7 5
9、.1 -4.3 20 Ct 目的基因 Ct 内参基因= Ct 为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理 Ct计算示例计算示例 28 选择一个对照样本选择一个对照样本 Untreated Treated 2 Treated 1 Cttarg. Ctnorm. Ct Ct 2(-ddCt) 26.1 16.7 9.4 0 1 23.8 16.0 7.8 -1.6 3 22.8 17.7 5.1 -4.3 20 29 选择一个对照样本选择一个对照样本 Untreated Treated 2 Treated 1 Cttarg. Ctnorm. Ct Ct 2(-ddCt) 26.1 1
10、6.7 9.4 0 1 23.8 16.0 7.8 -1.6 3 22.8 17.7 5.1 -4.3 20 Ct 处理样本 Ct 对照样本 = Ct 首先, 均一化对照样本 (如：对照样本 对照样本 ). 接着, 所有样本和对照样本进行比较(未知样本 对照样本). 30 选择一个对照样本选择一个对照样本 Untreated Treated 2 Treated 1 Cttarg. Ctnorm. Ct Ct 2(-ddCt) 26.1 16.7 9.4 0 1 23.8 16.0 7.8 -1.6 3 22.8 17.7 5.1 -4.3 20 Ct 处理样本 Ct 对照样本 = Ct 首先,
11、 均一化对照样本 (如：对照样本 对照样本 ). 接着, 所有样本和对照样本进行比较(未知样本 对照样本). 31 Ct倍数计算倍数计算 Untreated Treated 2 Treated 1 Cttarg. Ctnorm. Ct Ct 2(-Ct) 26.1 16.7 9.4 0 1 23.8 16.0 7.8 -1.6 3 22.8 17.7 5.1 -4.3 20 最后计算出倍数关系: 倍数变化 = 2-Ct 32 Ct倍数计算倍数计算 Untreated Treated 2 Treated 1 Cttarg. Ctnorm. Ct Ct 2(-Ct) 26.1 16.7 9.4 0
12、 1 23.8 16.0 7.8 -1.6 3 22.8 17.7 5.1 -4.3 20 相对定量 (RQ)值 最后计算出倍数关系: 倍数变化 = 2-Ct 33 对照样本对照样本 实验实验流程流程 t=0 t=12 t=24 t=48 time total RNA cDNA total RNA cDNA total RNA cDNA total RNA cDNA 目的基因 内参基因 34 我们来算一下 基因表达变化 DRn Cycles Ct=22 Ct=27 t=12 h DRn Cycles Ct=24 Ct=26 t=24 h DRn Cycles Ct=23 Ct=33 t=48 h DRn Cycles Ct=23 Ct=30 t=0 内参基因 目的基因 35 Sample Ct Plat
