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1、第一章 生化分离的研究历史1.生化分离工程：通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得生物化工产品，从上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程即称为生化分离工程或称下游加工过程。2.上游：菌种，基因工程，分子生物学，遗传学3.中游：微生物发酵工程，动植物细胞培养， 海洋生物培养4.下游：生物分离工程第二章 发酵液预处理1.生物分离过程的一般流程2.生物分离工艺要求：（1）高纯度；（2）大规模；（3）经济性；（4）生物相容性。3.对产物的要求：（1）保持生物产物的活性；纯度要求高；（2）当生物技术产品是食品或药物时，要求无污染物、无对映体、无病毒、无热原无致敏原；（3）从
2、发酵液和细胞培养液中提取所需生化物质的第一步，分两部分：预处理和固液分离。4.发酵液的成分：包含菌（细胞）体，胞内产物，胞外产物及剩余的培养基残分等。对于胞外产物，可先将菌体或其他悬浮杂质去除，才能从澄清的滤液中提取代谢产物。对于胞内产物，首先富集菌体，再进行细胞破碎和碎片分离，然后提取胞内产物。5.发酵液预处理的原因： （1）液相粘度大，大多为非牛顿型流体，不易过滤，所需物质多在液相；（2）发酵产物浓度较低，大多为 1-10%；（3）发酵液成分复杂，不利于提取产物。5.预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率（1）改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，
3、降低液体黏度；（2）相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。（3）尽可能使产物转移进入便于后处理的一相中（多数是液相）。6.发酵液杂质的去除：（不同杂质的去除方法：发酵液成分复杂，目标产物与各种杂质溶解在一起。这些杂质中对提取影响最大的是高价无机离子和杂蛋白。）（1）无机离子的去除：钙离子，在发酵液中加入草酸，可出去钙离子。镁离子，由于发酵液中镁离子含量通常不高，利用草酸很难完全出去镁离子。此时，可加入三聚磷酸钠，三聚磷酸钠与镁离子形成可溶性络合物，即可除去镁离子。铁离子，发酵液中的铁离子，一般用黄血岩去除，使其形成普鲁士蓝沉淀。（2）可溶性蛋白质的去除
4、：盐析法；等点沉淀法；有机溶剂沉淀法；其他沉淀法；加热法；吸附法A.盐析法：常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最多的硫酸铵。影响盐析的因素有：a.温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶解度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25）比 0时溶解度低，更容易盐析；b.pH 值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低；c.蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在 2.5-3.0%。B.
5、沉淀法：原 料 液细 胞 分 离 (离 心 ， 过 滤 )细 胞 胞 内 产 物 路 线 一 路 线 二细 胞 破 碎碎 片 分 离 路 线 一 A路 线 一 B 清 液 胞 外 产 物粗 分 离 (盐 析 、 萃 取 、 超 过 滤 等 )纯 化 层 析 、 电 泳脱 盐 (凝 胶 过 滤 、 超 过 滤 )浓 缩 超 过 滤精 制 (结 晶 、 干 燥 )包 含 体溶 解 (加 盐 酸 胍 、 脲 )复 性原 料 液细 胞 分 离 离 心 ， 过 滤细 胞 胞 内 产 物 路 线 一 路 线 二细 胞 破 碎碎 片 分 离 路 线 一路 线 一 清 液 胞 外 产 物粗 分 离 盐 析 、
6、 萃 取 、 超 过 滤 等纯 化 层 析 、 电 泳脱 盐 凝 胶 过 滤 、 超 过 滤浓 缩 超 过 滤精 制 结 晶 、 干 燥包 含 体溶 解 加 盐 酸 胍 、 脲复 性a.等电点沉淀法：蛋白质的等电点大都在酸性范围内(pH4.05.5) ，调节发酵液的 pH 到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。b.酸碱调节，使蛋白质与离子形成沉淀：在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子形成沉淀，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐等；在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子形成沉淀，如 Ag+、Cu 2+、Zn 2+、Fe 3+等。C.变性法：蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性。变性蛋白质溶解度
7、较小。变性方法：a.加热；b.大幅度调节 pH 值；c.加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。不足之处：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端 pH 值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。7.有色物质的去除：通常脱色方法为吸附法，如活性炭吸附和树脂吸附。8.发酵液性能的改善：（1）降低发酵液的粘度：加热（温度和时间）和稀释。（麦芽汁 40-75 ，粘度下降 50%）（2）调解 pH：蛋白、氨基酸等电点沉淀 ；减少膜的堵塞；利于细胞、细胞碎片和胶体的絮凝。9.凝聚和絮凝技术：凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中。（1
8、）凝聚是指在中性盐的作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。作用机理：（1）中和粒子表面电荷；（2）消除双电层结构；（3）破坏水化膜。（2）絮凝是指在某些高分子絮凝剂的存在下，基于桥架作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。作用机理：架桥作用。10.工业絮凝剂：（1）人工合成有机高分子聚合物；（2）天然有机高分子聚合物；（3）无机高分子聚合物。11.微生物絮凝剂：包括直接利用微生物细胞的絮凝剂、利用微生物细胞壁代谢产物的絮凝剂和克隆技术所获得的絮凝剂。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比
9、，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。12.影响絮凝的因素：（1）发酵液的性质（细胞浓度，表面电荷）；（2）絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一 半被聚合物覆盖；（3）絮凝剂的分子量；（4）pH 控制；（5）搅拌速度：初期搅拌要迅速一些，后期搅拌要慢。13.絮凝技术的应用：（1）去除细胞体、碎片、蛋白；（2）连续发酵中回收酵母；（3）生物产品分离。第三章 固液分离技术1.常见的固液分离方法：过滤、离心、膜分离、双水相萃取（ATPS）、扩张床吸附（EBA）2.发酵液分离：发酵液的分离非常困难，最常用的固液分离方法是过滤和离心。 体积较大的颗粒：过滤；体积较小的颗粒（1-10m）：离心；体积再
10、小：发酵液预处理后再过滤或离心。3.过滤介质：过滤采用的多孔物质；滤浆：所处理的悬浮液；滤液：通过多孔通道的液体；滤饼或滤渣：被截留的固体物质。4.影响过滤的因素 （1）推动力（悬浮液自身压强差、重力；悬浮液的外加压力；过滤介质的抽真空）；（2）悬浮液的性质（发酵液的黏度）；（3）过滤阻力（大多情况下，过滤阻力主要取决于滤饼阻力）；（4）影响发酵液固液分离的其它因素a.发酵液中悬浮离子的大小；b.菌体的种类和浓度（重要因素），通常丝状菌、动物或植物细胞悬浮液粘度较大，浓度增大，粘度也提高；c.培养液中蛋白质、核酸大量存在：通常细胞破碎或细胞自溶后粘度增大；d.培养基成分：如用黄豆粉、花生粉作氮
11、源，淀粉作碳源，粘度都会升高；e.某些染菌发酵液，如染细菌，则粘度会增大；f.发酵过程的不正常处理，如大量过剩的培养基和消沫油加入，都会使粘度增大。5.过滤速度的强化（1）降低滤饼比阻力：一切能够降低滤饼比阻力的方法：如添加电解质、絮凝剂、凝固剂助滤剂等；（2）降低滤液黏度 ：黏度愈低，过滤阻力愈小。加热、去杂蛋白、絮凝、调 PH、选择合适的放罐时间； （3）降低悬浮液中悬浮固体的浓度：过滤速度与获得滤饼体积成反比，因此应尽可能降低培养基配料浓度；（4）对发酵液进行预处理，改善滤液性质。6.错流过滤（切向流过滤）：传统过滤时过滤液体垂直于过滤介质，过滤阻力主要来自滤饼。错流过滤打破了传统过滤的
12、机制，即液体的流向和滤膜相切。在压力推动下，悬浮液以高速在管状滤膜的内壁作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走，而附着在滤膜上的滤饼很薄，因而能在长时间内保持稳定不变的过滤速度。7.离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。优点：分离速度快；分离效率高；液相澄清度好。8.离心机的种类与用途常速离心机：8000r/min，用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；高速（冷冻）离心机：1-2.5 104r/min，用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；超速离心机：转速 2.5-8104r/min，用于 DNA、RNA、蛋
13、白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度、沉降系数和相对分子量测定等。第 4 章 细胞破碎和分离提取技术1.不同类型的细胞分泌目标产物的类型：对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎动物细胞：多分泌到细胞外培养液；植物细胞：多为胞内产物；微生物：（细菌/酵母/ 真菌）胞内、胞外产物。2.细胞破碎：技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。3.细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。4.细胞破碎技术：A.机械破碎法：高压匀浆破碎法，高速珠研磨破碎法，超声波破碎法。机械破碎：通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞
14、破碎（捣碎法、研磨法、匀浆法、超声法）。高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，20%左右。 不宜使用高压匀浆法：易造成堵塞的团状或丝状真菌；较小的革兰氏阳性菌；含有包涵体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）。B.非机械破碎法：物理破碎：通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎（温度差破碎法、压力差破碎法、渗透压冲击法、冻结和融化法、干燥法）。化学破碎：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎（有机溶剂、表面活性剂、酸碱、EDTA 螯合剂）。酶促破碎：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破
15、碎（自溶法、外加酶制剂法）。第 5 章 生物产品萃取技术1.萃取：溶质从料液转移到萃取剂的过程。当含有生化物质的溶液与互不相溶的第二相接触时，生化物质倾向于在两相之间进行分配，当条件选择得恰当时，所需提取的生化物质就会有选择性地发生转移，集中到一相中，而原来溶液中所混有的其它杂质（如中间代谢产物、杂蛋白等）分配在另一相中，这样就能达到某种程度的提纯和浓缩。 2.反萃取：溶质从萃取剂转移到反萃剂的过程。在完成萃取操作后，为进一步纯化目标产物或便于下一步分离操作的实施，将目标产物从有机相转入水相的操作就称为反萃取。3.双水相现象：是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚
16、合物与盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两相。因使用的溶剂是水，因此称为双水相。常用的双水相体系：PEG/葡聚糖体系 和 PEG/磷酸盐体系 。PEG/葡聚糖体系一般用于小规模 地分离生物大分子、膜、细胞等；PEG/ 无机盐体系主要用来大规模地提纯酶，这是因为 PEG/无机盐体系的萃取专一性更高，葡聚糖价格昂贵的缘故。双水相萃取的基本特点：体系有生物亲和性；非常适合大规模应用；操作容易进行控制；可与细胞破碎相结合；能进行萃取性的生物转化；可进行亲和萃取。双水相萃取的优点：操作条件温和，在常温常压下进行；两相的界面张力小，两相易分散；两相的相比随操作条件而变化；易于连续操作，处理量大，适合工业应用。双水相萃取的工艺流程：目的产物的萃取：使目标蛋白质分配到上相( PEG 相) ，而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相(富盐相) ；PEG 的循环 ：加入盐使蛋白质转入富盐相回收 PEG；将 PEG 通过离子交换树脂，先洗出 PEG，再洗出
