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1、小麦胚芽中酸性磷酸酶的分离纯化,临床生物化学教研室,酶分离纯化的过程,选择原料 组织及细胞破碎 酶的抽提 酶的纯化,常用的酶分离纯化方法,盐析法 有机溶剂沉淀法 离心法 电泳法 层析法 吸附法 透析法,一、实验目的,掌握小麦胚芽中分离纯化ACP的原理 熟悉小麦胚芽中分离纯化ACP的操作过程 了解常用的酶分离纯化技术,二、实验原理,酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP) 广泛分布于自然界中，存在植物种子、霉菌、以及动物肝脏和前列腺中。 植物种子中的ACP在发芽时含量会猛增，随芽胚的生长ACP含量会下降。选用新鲜小麦胚芽作为原料来分离和纯化ACP，具有来源方便、酶含量高等优点。,二
2、、实验原理,ACP能溶解于水和稀缓冲液中； 溶于35%饱和度的硫酸铵溶液中，在57%饱和度的硫酸铵溶液中可沉淀析出； pH小于6.5时稳定性增加，乙酸和枸橼酸可增加ACP溶液的稳定性； 在中性及高温条件下不稳定，在70时相对稳定； Mn2+、Mg2+为ACP激活剂，而Cu2+、Pi、Hg2+、Zn2+、Ag+、Pb2+、NaF、草酸盐、酒石酸盐和甲醛等是ACP的抑制剂。,三、实验试剂,1mol/L MnCl2溶液 饱和(NH4)2SO4 溶液(pH 5.5，4) 按76.7g (NH4)2SO4，加蒸馏水溶解至100ml 0.25 mol/L EDTA钠盐溶液(pH 5.7) 甲醇-30预冷
3、新鲜麦芽50 g,四、操作步骤,1.小麦胚芽的准备 选取饱满、新鲜的小麦粒，冷水洗涤，除去干瘪的麦粒及泥沙，再用冷水浸泡24d (天热时4h左右)使麦粒发胀。将发胀的麦粒平摊于沥水的覆盖有2层纱布的塑料筐中，上面覆盖双层湿的纱布，置于通风处，每天浇水23次，保持麦粒的湿度。一般情况下，发胀的麦粒在室温20情况下，经34d就可以发出胚芽。在此过程中应注意通风透气，否则麦粒会发霉。,四、操作步骤,2.小麦胚芽中ACP的初步提取 称取新鲜小麦胚芽50g，加冷蒸馏水100ml，用捣碎器在高速、间断条件下冰浴捣碎35min，得到麦芽匀浆，将麦芽匀浆用24层纱布过滤，尽量将液体挤出，弃去纱布上固体物。,四
4、、操作步骤,3.ACP的纯化 本实验采用分级离心+分段盐析法+热变性+有机溶剂沉淀法： ACP与其它成分（细胞膜、杂蛋白）密度不同，以此逐步离心分离； ACP能溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液，在70C仍保持稳定，以此进行杂蛋白的变性沉淀和分段盐析。,ACP分离纯化的步骤流程,小麦胚芽50g+100ml冷蒸馏水,滤 液（固体物弃去）,研碎，4层纱布过滤,7000 rpm，离心5min,记录体积上清液 I 留3ml置于冰箱,9000 rpm，离心5min,1mol/L MnCl2 2ml/100ml上清液 I,记录体积上清液 II 留3ml置于冰箱,（激活并稳定ACP， 沉淀杂蛋白）,缓慢搅拌,7
5、000rpm，离心5min,上清液,7000rpm，离心5min,饱和硫酸铵 54ml /100ml上清液 II， 达35%饱和度,上清液 II,（溶解ACP， 沉淀杂蛋白）,7000rpm，离心5min,记录体积上清液 III 留3ml置于冰箱,62C水浴2min，迅速冷却至68 冷水浴3min,饱和硫酸铵 51ml /100ml上清液， 达57%饱和度,沉淀（酶粗提物）,（ 沉淀ACP）,缓慢搅拌,缓慢搅拌,ACP分离纯化的步骤流程,9000rpm，离心5min,约1/3上清液 III蒸馏水溶解、洗涤,（溶解ACP， 沉淀杂蛋白）,7000rpm，离心5min,记录体积上清液 IV 留3m
6、l置于冰箱,沉淀（酶粗提物）,（ 沉淀ACP）,EDTA0.09ml/1ml、饱和硫酸铵0.1ml /1ml、-30预冷甲醇2ml/1ml上清液 IV,沉 淀（酶纯化物）,7000rpm，离心5min,10ml蒸馏水 溶解洗涤,（酶液）记录体积上清液 V 全部保留置于冰箱,ACP分离纯化的步骤流程,（ 溶解ACP）,五、注意事项,制备小麦胚芽时不宜让麦苗长出，尽量取小麦胚芽部分，因麦粒和麦苗部分ACP活性较低。同时要弃去发霉变质的麦胚。 1 mol/L MnCl2起稳定酶蛋白和除去杂蛋白的作用。 (NH4)2SO4的最终饱和度要严格控制，ACP溶于35%饱和度的(NH4)2SO4溶液中，一些杂蛋白沉淀析出。当(NH4)2SO4饱和度增加至57%时，ACP则不溶解，从溶液中析出，某些杂蛋白仍溶于上清液中。,操作中要控制好要求的温度，ACP在70时稳定，加热至62为了除去一些不耐热的杂蛋白。 甲醇的作用是降低溶液的介电常数，使酶蛋白脱水而从溶液中析出，从而除去杂蛋白。由于有机溶剂沉淀蛋白质常引起蛋白质的变性，因此，低温条件非常重要，甲醇要保持低温。,五、注意事项,
