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1、第四节 高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography, HPLC,一、概述 气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。所以，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱。,通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。,二、高效液相色谱仪,输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统,1、输液系统,(1) 高压输液泵 高压输液泵是液相色谱仪的关键
2、部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。 输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。,高压输液泵 在线脱气装置,(2)在线脱气装置 在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。 除在线脱气装置外，目前也采用超声脱气、真空脱气等方式。,脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线飘溢，噪音增加。,（3）梯度洗脱装置 通过两个输液泵流速的变化，改变流动相的洗脱能力，其作用与气相色谱的程序升温类似。,A,B,A,B,C,C,2、进样系统 通常采用六通伐进样：,色谱柱,色谱柱,泵,泵,1,2,进样,3、色谱柱,Normal column5-u
3、m、4.6-um Narrow bore column1-3 um Micro column 1 um,色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。,4、检测器,作用 用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。 目前最常用的检测器主要有：,紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器,（1）紫外-可见检测器,光源,检测室,光栅,二极管阵列检测器,（2）荧光检测器 许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。但可以与发荧光物质反应衍生
4、化后检测。 特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高23个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。,荧光检测器结构示意图,光源,检测器,滤光片,检测室,（3）蒸发光散射检测器,蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。,（4）电化学检测器（以电导检测器为例）,三、液相色谱分离模式,一、吸附色谱（adsorption chromatography） 原理：基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。 固定相： 固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液
5、固吸附色谱。活性硅胶最常用。,流动相： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。,二、分配色谱,应用： 吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。,原理： 主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。,液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去了。,
6、键合固定相,非极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS（Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18柱就是最典型的代表，其极性很小。 极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。,正相HPLC（normal phase HPLC）： 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。 反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相
7、色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。 ODS（Octa Decyltrichloro Silane),三、体积排斥色谱 （又称凝胶色谱和分子筛色谱） 原理： 以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。,大分子全排出VR = V0 小分子全进入VR = V0 + VS 中分子部分进入VR = V0 + KVS,四、离子交换色谱 （ion exchange chromatography, IEC） IEC使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定
8、相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离，带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而被相互分离。,SO3H + M+,SO3M + H+,抑制柱离子色谱的原理： 以阴离子分析为例： 分析柱反应： RCl + NaOHROH + NaCl 抑制柱反应： RH + NaCl RNa + HCl RH + NaOHRNa + H2O,第五节毛细管电动色谱 一、电迁移原理,高压电源,D,电迁移率E电场强度L支持体长度,带电粒子在电场中移动的速度正比于电位梯度,q电量r离子半径溶剂粘度,在一定的电迁移的条件下，两个组分的电荷 q 及 半径 r 不同，迁移的速度就不同，因此可以被电泳分离。 显然，电泳法不适合中性分子的分离。,二、电渗流（EOF）,三、电色谱 在柱中加入胶束试剂如SDS，形成胶束，因为SDS是阴离子，向阳极移动，但EOF溶液向阴极运动，带动组分向阴极移动，与胶束相互作用，达到分离目的。,目前已制备出填充有固定相的毛细管电动色谱柱：,
