《PCR-SSCP实验操作详细步骤》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR-SSCP实验操作详细步骤（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、PCR-SSCP 实验步骤 一样品制备 1PCR 扩增并检测。 根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR 扩增。扩增产物用2-2.5% 的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量3-5ul 。PCR 产物为 10ng/nl左右为最佳。 2PCR 产物与变性buffer混合。在干净的PCR 管底部加入5ul SSCP 上样缓冲液（变性缓 冲液，同分子克隆中的测序缓冲液），然后在缓冲液中央加入PCR 扩增产物。按照经验，扩 增效果在琼脂糖胶上能看出比较亮的带的样品加1ul ，效果很好加0.5ul ，如果不太好就适当增加 1.5、2 或 3 不等，同时加大上样缓冲液的量，比如加3ul 的 PCR 产物，缓冲
2、液加到8ul 变性效 果更好。 3PCR 产物变性。加好的样品进行离心，使样品集中在管底。PCR 仪上 95变性 10 分钟， 立即取出 PCR 产物连同架子一同置于冰上静置5min ，以免变性的产物复性。 注： 3 和 4 步可以在制SSCP 胶第四步后，等胶凝的过程中进行。 二制胶 1 装板。在所要进行实验的每一副玻璃板先用自来水冲洗，然后使用ddH2O 冲洗，然后使用 吸水纸将玻璃板擦拭干，然后再玻璃板上涂抹无水酒精，待2-3min酒精挥发。将玻璃板组 装好放入凝胶架子中，两边及底部固定好，两玻璃板保持水平，然后将发条拧紧。 （可用无水 乙醇测试是否漏胶） 。 2配胶。 甘油浓度50%
3、的几种浓度大板胶（10ml 下层胶， 5ml 浓缩胶）配方（两块胶1.0mm ） ： 8% 6% 30%PAGE 2.7ml 1ml 10TBE 1ml 0.5ml 50% 甘油1ml 0.5ml ddH2O 5ml 3ml APS 70ul 70ul TEMED 12ul 8ul Total 10ml 5ml 甘油浓度50% 的几种浓度小板胶（15ml 下层胶， 10ml 浓缩胶）配方（两块胶1.5mm ） 8% 6% 30%PAGE （4） 4.05ml 2 ml 10 TBE 1.5ml 1m 50% 甘油1.5m 1m ddH2O 7.5ml 6ml APS 105ul 70 ul T
4、EMED 12ul 12ul Total 15ml 10ml 3灌胶。配好胶后搅匀，灌入装好的玻璃板中，注意不能产生气泡，如果产生气泡把板立起， 轻轻敲打可使气泡升出胶面，胶面与凹板上沿大约差0.5cm时插上梳子，要保证梳子齿和液面接 触处没有气泡，一旦产生要拔出重插。 4静置。灌好的胶平放或与水平成一比较小的角度（10 o 以下）静置水平桌面上30min左右使 之充分聚合。 注：此时可以进行PCR 样品变性，即第一部分的3、4 步。 二 上样 1.安板。 PAGE 聚合好后要及时拔出梳子（时间耽搁长后会使梳子很难拔出），拔梳子时要用力均 匀以保持胶孔的整齐。用夹子把胶板固定在电泳槽上，凹槽的
5、一面朝里，安板时首先使板的底边 一端先接触电泳液，再缓慢地过度到另一端，以免产生大气泡（产生大气泡会使电泳条带弯曲）。 2预电泳。从底槽把一些电泳液1TBE 吸到上槽，使液面高出玻璃板矮边1cm 以上，并确保 上槽不漏液。打开电源，大槽电压调到140-150V，小槽110-120V，预电泳10min左右。 (0.1W/cm,10， 1-3h) 3点样。用微量进样器把准备好的样品按顺序加到胶孔中。由于边缘效应带型不整齐，每块板 中最边上的两个孔最好不要点样。 4电泳。大槽电压140-150V，小槽 110-120V，温度在 10-15 ， 恒温电泳10 个小时以上。 三 染色 1固定。把胶卸下，
6、做好起始记号，放入70% 乙醇中在摇床上固定15min 。固定好后乙醇回收 （可以重复使用5 次左右），蒸馏水洗两遍，每遍 3min左右。若同时染两块胶固定和洗脱都要适 当增加时间。 2染色。染色液（200ml染色液含3.6% 的 NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml 、氨水 2ml ）染 色 30min ，同时染两块胶要适当增加时间，需40min左右。倒掉染色液，洗3 遍，每遍3min ， 同时染两块胶要适当增加时间。 3显色。显色液（200ml显色液包含1%柠檬酸钠1ml ，甲醛 100ul ）至清晰。倒掉显色液， 加蒸馏洗脱3 次停显。 (也可将凝胶浸在含0.5ug/ml溴化锭
7、的1TBE 缓冲液中染色10min ，在紫外灯下观察) 附录 1. 甘油浓度 50% 的几种浓度大板胶（10ml 下层胶， 5ml 浓缩胶）配方（两块胶1.0mm ） ： 8% 6% 30%PAGE 2.7ml 1ml 10TBE 1ml 0.5ml 50% 甘油1ml 0.5ml ddH2O 5ml 3ml APS 70ul 70ul TEMED 12ul 8ul Total 10ml 5ml 2. 甘油浓度50% 的几种浓度小板胶（15ml 下层胶， 10ml 浓缩胶）配方（两块胶1.5mm ） 8% 6% 30%PAGE 4.05ml 2 ml 10 TBE 1.5ml 1m 50% 甘
8、油1.5m 1m ddH2O 7.5ml 6ml APS 105ul 70 ul TEMED 12ul 12ul Total 15ml 10ml 310 TBE 的配方： 108g Tris碱、 55g 硼酸、 40ml 0.5mol/lEDTA(pH8.0)定容 1L 4.变性 buffer的配方 98% 去离子甲酰胺、10mmol/LEDTA(pH8.0)、0.025% 二甲苯青FF、0.025% 溴酚蓝 注意事项： 重复性 .影响SSCP 重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变，SSCP 图谱可保持良好的重复性.一般 SSCP 图谱是二条单链DNA 带，但有时有的DNA
9、片段可能只呈 现一条 SSDNA 带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA 之间存在相似的立体构象.有时 三条以上的SSCP 图谱是由于野型DNA 片段和突变型DNA 片段共同存在的结果. 靶 DNA 序列长度的影响在实验中发现SSCP 对短链 DNA 或 RNA 的点突变检出率要比长 链的高，这可能是由于长链DNA 和 RNA 分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小 的缘故 .而有人认为在DNA 链较短的 (400bp以下 )情况下， DNA 的长度不会影响SSCP 的效果 . 电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA 保持一定的稳定立体构象，SSCP 应在较低温度 下进行 (一
10、般4-15 之间 ).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原 因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP 时，开始的5min应用较高的电压 (250V) ，以 后用 100V 左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA 初步 分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使之进一步分离.在实验中应根据具体实验 条件确定电泳电压. SSCP 的结果断定 :由于在 SSCP 分析中非变性PAG 电泳不是根据单链DNA 分子和带电量 的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分 离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出两者之间的差别.因此 一般要求电泳长度在16-18cm以上，以检测限为指标来判定结果.检测限是指突变DNA 片段与 正常 DNA 片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该 DNA 序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化.例如，一般检测限定为3mm ，那么当两带间距离 在 3mm以上，则说明两链之间有改变.另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假 阳性结果 .另外， SSCP 分析中其它条件，如PCR 产物的上样量，PAG 的交联度、以及胶的浓度 等，都应根据具体实验进行选择确定.
