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1、1膀胱肿瘤细胞多药耐药检测在浸润性膀胱肿瘤治疗中的应用作者：吴小鹏，陆曙炎，蔡雷铭，邹建纲，周忠兴，关乃富，陈仰之，陈静 【关键词】 膀胱肿瘤Effect of histamine H3 receptors in nucleus tractus solitarius on c-Fos expression in the brain of rats with asthma onset Abstract:Objective To explore the effect of histamine H3 receptors in nucleus tractus solitarius（NTS）on c-F
2、os expres-sion in the brain of rats with asthma onset.Methods Male Sprague-Dawley（SD）rats were sensitized with ovalbumin to in-duce asthma using central stereotaxic and microinjection techniques.The model rats were randomly divided into three groups，injected NS，R-methylhistamine（RMHA，a H3 receptor r
3、eceptors agonist） ，and thioperamide（Thio，a H3 receptors antago-nist）2+RMHA into NTS respectively.Fos positive cells distributed in different nucleus were detected by immunohistochemistry SABC method after the challenge one hour later.Results After microinjection1g RMHA into NTS at the onset of asthm
4、a，the number of Fos positive cell and Fos density presented in NTS，periventricular hypothalamic nucleus（Pe ） ，hypothalamic paraventricular nucleus（Pa ） ，and raraventricular thalamic nucleus（PVN）decreased markedly（P0.01 ）.These effects can be blocked by pre-treatmentwith5g microinjection of Thiop int
5、o NTS.Conclusion This study suggests that histamine H3 re-ceptors in NTS can ameliorate asthma via regulating some neurons in Pa，Pe and PVN.Key words:rats;nucleus tractus solitarius;histamine H3 receptors;asthma;Fos protein;expression摘要目的: 检测膀胱肿瘤细胞多药耐药情况，以选择敏感药物治疗浸润性膀胱肿瘤。 方法: 双侧髂内动脉灌注化疗前采用免疫组织化学方法对
6、10 例膀胱肿瘤病例作多药耐药糖蛋白（ P.gp） 、谷胱甘肽 S 转移酶（GST.p）和拓扑异构酶 （Topo）表达情况检测。 结果: 灌注前 P.gp 的表达率为 30%，GST.p 为310%，Topo 为 50%。灌注药物选择吡柔比星、顺铂和羟基喜树碱。灌注后 P.gp 的表达率为 50%，GST.p 为 10%，Topo为 40%。结论: 检测 P.gp、 GST.p、Topo表达情况对浸润性膀胱肿瘤化疗药物的选择具有重要意义。关键词 膀胱肿瘤;多药耐药;免疫组织化学;化学治疗多药耐药（MDR）是导致肿瘤化疗失败的重要原因，多药耐药糖蛋白（P.gp）是引起 MDR 现象最常见的因素之
7、一。2003 年10 月至 2005 年 3 月，作者对 10 例浸润性膀胱肿瘤患者进行P.gp、谷胱甘肽 S 转移酶（GST.p）和拓扑异构酶（Topo）表达情况的检测，根据检测结果选择敏感药物作髂内动脉灌注化疗，观察化疗前后耐药情况的变化，现报告如下。 1 资料与方法1.1 一般资料本组 10 例，男 9 例，女 1 例;年龄 4984 岁，平均 65 岁。10 例均经膀胱镜活检，病理检查证实:移行细胞癌 级 4 例，浸润至肌层，有盆腔淋巴结转移，T3 期;级 2 例，浸润至肌层，T2 期; 级 3 例，T1 期。高分化鳞癌 1 例，浸润至肌层，T1 期。 41.2 方法采用 Seldin
8、ger 技术，局部麻醉下右侧股动脉插入F4.5Cobra 导管，分别进入髂总动脉、髂内动脉，选择性插管进入双侧膀胱上、下动脉，造影显示膀胱肿瘤的血供及血管分布情况，对肿瘤供血动脉联合应用顺铂（DDP） 、吡柔比星（ THP）和羟基喜树碱（HCPT）等化疗药物灌注。灌注药物的剂量:DDP6070mg、THP4050mg、HCPT25mg。免疫组织化学方法采用 DA-KO 公司 Envision 系统，一抗均为原装浓缩产品。P.gp抗体、GST.p 抗体、Topo 抗体均购自 DAKO 公司。送检标本 10%中性福尔马林固定;常规取材、乙醇脱水、石蜡包埋，常规切片、烤片入二甲苯脱蜡，经不同浓度的乙
9、醇入水、入蒸馏水、入 PBS 缓冲液 10min;组织切片视需要抗原修复 2030min后自然冷却 15min，加一抗抗体孵育 3040min，PBS 缓冲液冲洗 10min，滴加 Envision 检测系统孵育 3040min ，PBS 缓冲液冲洗 10min，滴加 DAB 显色液 1015min，自来水冲洗 10min，苏木精染色液细胞核染色 510min ，组织细胞核分化 1min，组织细胞核返蓝 10min，乙醇、二甲苯常规脱水、透明 30min，中性树胶盖玻片封片。试剂由 DAKO 公司提供。51.3 阳性判定的标准P53、Topo 的阳性颗粒定位于细胞核，染棕黄色;bcl.2、 V
10、EGF、P.gp、GST.p 的阳性颗粒定位于细胞质或细胞膜。判定标准采用半定量方法，根据阳性细胞的数目，10%以下为， 10%30%为+ ，31%50%为+ ，50%以上为+。 2 结 果3 例 P.gp 呈阳性（+） ，2 例 GST.p 呈阳性（+ +） ，5 例 Topo为阳性（+） 。灌注药物选择:P.gp 阴性、GST.p 阴性者选择 THP 加 DDP;P.gp 阳性、GST.p 阴性、Topo 阳性者选择 HCPT。灌注化疗后 710d，9 例手术切除肿瘤，标本再作免疫组织化学耐药测定。1 例 P.gp 由+ 降为+，1 例 P.gp+者仍为+，1例 P.gp+者仍为为+，1
11、例 P.gp 由+变为+，1 例 P.gp 阴性者变为+;1 例 GST.p 由-变为+，1 例 GST.p 仍为+;4 例 To-po由+ +变为+ ，1 例 Topo由+变为-。2 例灌注后 1 周行膀胱全切除术，分别随访 6 个月和 3 个月无复发;4 例行膀胱部分切除术，随访 6 个月以上无复发 ;1 例行经尿道膀胱肿瘤电切术，随访 1 年无复发;1 例未手术，随访 10 个月复6查 CT，膀胱肿瘤范围无明显增大，无血尿，排尿通畅;2 例行膀胱部分切除术者术后时间较短，尚无随访资料。 3 讨 论膀胱癌是常见的泌尿系统肿瘤，具有易复发和产生多药耐药的生物学特性。复发肿瘤期.级上升，容易产
12、生耐药性。肿瘤细胞的药物耐受是影响化疗效果的最重要因素。有统计显示，90%以上肿瘤患者的死亡都不同程度地与药物耐受有关。动脉灌注化疗是治疗浸润性膀胱肿瘤的重要手段之一，但传统灌注药物的选择带有一定盲目性。检测肿瘤细胞的耐药谱可指导临床用药，因此，根据膀胱肿瘤 MDR 免疫组织化学检测结果选择敏感化疗药物进行动脉灌注化疗具有重要的临床指导意义。本科开展髂内动脉灌注化疗结合手术治疗浸润性膀胱肿瘤，患者 1 年生存率达 91%1 。动脉灌注化疗能使多数浸润性膀胱肿瘤明显降期，使许多患者保留功能完整的膀胱，并能使部分高分期患者接受根治性膀胱全切除术，提高手术切除率2 。P.gp 是由 MDR 基因 m
13、dr.1 编码的一个相对分子质量为17000 的跨膜糖蛋白，具有依赖 ATP 的生物膜功能，可将多种化疗药物从胞内泵出胞外，从而导致耐药。转基因实验已经证实，肿瘤7细胞中由于 P.gp 过度表达，使细胞毒性药物被泵出细胞外，细胞内药物浓度下降，从而产生耐药3 。GST.p 可与多种毒性药物结合，起解毒作用。相当多的抗肿瘤药物都是 GSH.GST 系统的作用底物，降低细胞内 GSH 浓度可以增加肿瘤细胞对许多药物的敏感性4 。DNA Topo可催化 DNA 超螺旋局部变构，使 DNA 松懈，影响细胞增殖和分化，在 DNA 复制、转录、有丝分裂染色体分离、DNA 修复中均起关键作用，Topo是肿瘤
14、化疗的重要靶酶。MDR 细胞株 Topo含量降低而产生药物耐受。许多抗癌药物是以Topo为靶点的，其作用是使酶.DNA 易解离复合物形成，最终引起细胞凋亡。高水平 Topo表达是药敏基础，特别是Topo 5 ，提示我们对于 To-po 高表达的肿瘤，可使用Topo 抑制剂 VP.16、阿霉素作为术后预防性灌注化疗的首选药物。P.gp 在许多正常组织中缺乏，已经证实 P.gp 高表达的肿瘤细胞对阿霉素、表阿霉素、米托蒽醌等药物耐受，GST.p 高表达的肿瘤细胞对阿霉素、DDP 等药物耐受，Topo低表达的肿瘤细胞对阿霉素、表阿霉素、柔红霉素耐受。人体肿瘤组织内存在 MDR 基因。本组 9 例作了
15、灌注化疗前后肿瘤细胞耐药检测，并进行比较，发现化疗药物会升高 P.gp 的表达，降低 Topo 的表达，使肿瘤细胞对化疗药物敏感性降低，产生耐药性。8作者治疗浸润性膀胱肿瘤的程序是:（1）作膀胱肿瘤活检和肿瘤细胞耐药检测;（2）选择敏感药物作髂内动脉灌注化疗 ;（3）手术切除肿瘤;（4）标本作肿瘤细胞耐药检测;（5）选择敏感药物定期作膀胱内灌注化疗。本组 10 例均在灌注化疗前作膀胱镜活检和肿瘤MDR 免疫组织化学检测，P.gp-、GST.p-者选择 THP 加DDP;P.gp+、Topo+者选择 HCPT。作者的体会是:在临床上制订化疗方案前，应先作肿瘤细胞 MDR 检测，观察有无耐受蛋白的
16、表达，避免采用 P.gp、GST.p 和 Topo 耐药谱中的药物。既要考虑P.gp 因素，又要考虑 GST.p 和 Topo 因素，对复发者及时修改化疗方案，以便取得更好的疗效。随着医学分子生物学技术的发展，肿瘤细胞的耐药检测为膀胱肿瘤化疗的敏感药物选择提供了更科学的依据。本研究病例有限，随访时间较短，尚待积累病例进行更进一步的研究。参考文献 1吴小鹏，陆曙炎，邹建纲，等. 浸润性膀胱肿瘤的治疗J. 北京医药，2003， （4）:241.242. 2李鸣，李宁忱，黄真，等. 浸润性膀胱癌术前选择性髂内动脉灌注化疗的近远期疗效观察J.中华泌尿外科杂志，92004， （10）:662.664. 3DASCHNER P J，CIOLINO H P，PLOUZEK C A，et al.I
