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1、.shRNA干扰载体构建SOP目录第一部分 RNA干扰原理及shRNA设计2第二部分 酶切与回收3第三部分 退火与连接3第四部分 转化与涂平板3第五部分 挑菌与菌液PCR3第六部分 质粒提取3第一部分 RNA干扰原理及shRNA设计标准操作规程(SOP)1. 目的：了解RNA干扰原理，设计shRNA干扰序列2. 仪器与设备：需要能够连接Internet的个人计算机，引物设计相关软件(如Primer Premier 5)。3. 操作步骤3.1 RNA干扰原理1) RNAi概述： RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-st
2、randed RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。2) RNAi原理：
3、RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入的双链RNA，形成19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-indu
4、ced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上，并在距离siRNA 3端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。3) RNAi示意图(见图1)3.2 shRNA设计1) shRNA: 即short hairpin RNA(短发卡RNA) ，包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补)，中间由一个loop序列分隔，组成发夹结构。shRNA在体内可以被加工成siRNA从而降解目的基因.。
5、示意图见图2。2) shRNA作用原理：见图3。3) shRNA设计原则：l 克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由pol启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶的转录终止子；l 两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点；l StrataGENE发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因；l 在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生；l shRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧
6、连正义链的上游加一个G；l ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。在比较了众多不同长度和序列的茎环，5TCAAGAG3序列最为有效(AMBION use)；l 5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录(stop)；l 在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T，这可能导致shRNA转录的提前终止；l 从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位
7、点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。图1 RNAi原理图2 shRNA示意图 图3 shRNA作用原理4) shRNA设计举例l 以人源基因VEGFC为例，选取干扰靶点序列为：GCCGATGCATGTCTAAACTl 在该序列两端加上酶切位点，中间插入Loop环，设计shRNA片段：BamH I 靶点序列 环结构 靶点反义序列 Hind IIIGATCC GCCGATGCATGTCTAAACT TTCAAGAGA AGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTT A G CGGCTACGTACAGATTTGA AAGTTCTCT TCAAATCTGTACGT
8、AGCCGAAAAAA TTCGAl 正反向Oligo序列分别为：H-VEGFC-sh-F:5-GATCCGCCGATGCATGTCTAAACTTTCAAGAGAAGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTTA-3H-VEGFC-sh-R:5-AGCTTAAAAAAGCCGATGCATGTCTAAACTTCTCTTGAAAGTTTAGACATGCATCGGCG-3 将该Oligo片段正反向一起混合退火后，即可直接与载体进行连接，构建shRNA干扰载体。第二部分 干扰载体pRNAT-U6.1概述标准操作规程(SOP)实验名称shRNA干扰载体构建SOP S2：干扰载体pRNAT-U6.1概述
9、起草人修订人何章荣修订日期2015.7审核人审核日期批准人批准日期颁发部门1. 目的：了解干扰载体pRNAT-U6.1的特点2. pRNAT-U6.1载体概述l 带有U6启动子，保证shRNA的高表达；l 带有GFP标签，可用于检测转染效率；l 带有多克隆位点；l 带有新霉素(Neomycin)抗性，可用于筛选稳定细胞株3. pRNAT-U6.1载体图谱图1 pRNAT-U6.1载体图谱第三部分 酶切与回收标准操作规程(SOP)实验名称shRNA干扰载体构建SOP S3： 酶切与回收起草人修订人何章荣修订日期2015.7审核人审核日期批准人批准日期颁发部门1. 目的：通过酶切可以获得带酶切位点
10、的线性化质粒载体，使用试剂盒对其进行回收。2. 试剂与材料名称公司货号限制性内切酶Thermo1.5mL tubeAxygen0.2mL PCR tubeAxygenCycle Pure Kit OMEGAD6492-013. 仪器与设备名称公司货号MAXYGENE Thermal CyclerAxygenMaxyGeneGradient移液器大龙掌上离心机其林贝尔LX-200恒温水浴锅精宏DK-804. 操作步骤4.1 酶切以Thermo内切酶为例，准备好冰盒，将所需试剂从冰箱中取出后置于冰上，待试剂融化后，在0.2mL离心管中加入：10buffer Tango 5L 内切酶HindIII
11、1L 内切酶BamHI 1L shRNA干扰质粒pNAT-U6.1 1g ddH2O up to 50L盖紧管盖，离心15s。将0.2mL离心管置于离心管架上，放入37水浴锅中，酶切1h(时间长短根据酶的反应效率而异，可参考产品说明书)。也可以直接使用PCR仪进行酶切反应。Notes: l 根据酶的特点，可能要求用到BSA，可根据说明书进行操作。双酶切时，如果仅其中一种酶需要用到BSA，则也需要在酶切体系中加入BSA，因为BSA不会影响内切酶的活性。l 若两个位点的内切酶使用相同缓冲液(即在该种缓冲液里酶活性最高)，可加入两种酶同时进行反应l 若使用不同缓冲液，则可先进行单酶切，回收后再进行第
12、二次酶切，再次回收。l 由于载体上的两个酶切位点一般相距较近，有些酶需要更多的保护碱基，则同时进行双酶切可能效率不高。可先加入需要更多保护碱基(或是酶切效率较低)的内切酶，反应结束后回收(如果两种酶使用同一类缓冲液，则可省去回收步骤)，再加入第二种酶进行反应。酶切后的载体通过凝胶电泳分离然后回收纯化，去除切割下来的小片段，从而降低假阳性。4.2 酶切产物回收以OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒为例。1) 将酶切产物转移至1.5mL 离心管，加入4-5倍酶切产物体积的Buffer CP；如果PCR片段长度小于200bp，则加入6倍体积的Buffer CP；2) 漩涡震荡混匀，短暂离心
13、，收集管壁上的液体；3) 将混合物加入至试剂盒提供的HiBind DNA吸附柱，10000g，室温离心1min；4) 弃残液，加入700L DNA WASH Buffer，10000g，室温离心1min；5) 重复步骤4；6) 弃残液后，13000，室温离心2min；7) 将HiBind DNA吸附柱置于干净的1.5mL 离心管，加入15-30L Elution Buffer或ddH2O，室温放置1-2min，13000，室温离心2min，收集DNA产物。第四部分 退火与连接标准操作规程(SOP)实验名称shRNA干扰载体构建SOP S4：退火与连接起草人修订人何章荣修订日期2015.7审核人审核日期批准人批准日期颁发部门1. 目的：将单链的shRNA上下游片段进行退火，形成双链DNA片段，随后连接至酶切后的载体。2. 试剂与材料：名称公司货号5退火缓冲液自制shRNA Oligo片段华大基因ddH2O自制0.2mL PCR TubeAxygenpRNAT-U6.1/Neo质粒载体金斯瑞T4 ligase康为生物CW08053. 仪器与设备名称公
