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1、第五章 酶的固定化 游离酶的缺点： 稳定性差(热、酸碱、有机溶剂对其有影响)； 不能回收反复使用； 产物中混杂酶蛋白，分离纯化困难。 酶的固定化 (enzyme immobilization)就是通过吸 附、交联、包埋、共价键结合等物理、化学手段将 酶被束缚于水不溶的载体上或一定空间内但仍具有 酶活性。（上世纪60年代） 酶管、酶膜、酶板 第一节 酶的固定化方法 一、固定化酶的优缺点 1、优点 酶与底物、产物易分开，简化了提纯工艺； 可反复使用，利于连续化、管道化； 反应过程可控，利于自动化； 提高了酶的稳定性（绝大多数情况）； 酶的使用效率高、产率高、产品质量高、成 本低。 2、缺点 损失酶
2、活力 2）不适应非水溶性底物和大分子底物 不适于多酶反应 二、酶的固定化方法 吸附法、共价结合法、交联法、包埋法 1、吸附法 吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。 物理吸附法 通过氢键、疏水作用和、电子亲和力等物理作 用，将酶固定于水不溶载体上，从而制成固定化酶 。 常用的载体有： 有机载体：纤维素(玻璃纸或胶棉膜 )、淀粉等， 吸附量大 无机载体：氧化铅、皂土、多孔玻璃等，吸附 量小，易脱落 离子交换吸附法 将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达 到固定化。 阴离子交换剂：二乙基氨基乙基（DEAE）-纤维 素、DEAE-葡聚糖凝胶 DEAE-Sephadex A25固定氨基酰化酶：溶胀
3、，然 后用0.5mol/LNaOH和水洗涤，加酶混匀，于低温下 搅拌过夜，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15molL 醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4备用。 阳离子交换剂：羧甲基（CM）-纤维素 吸附法的优点：a、操作简单；b、载体选择范围 广；c、吸附过程可以同时纯化酶；d、固定化酶在 使用过程失活后可重新活化；e、载体可以回收再利 用。 吸附法的缺点：a、由于有些机理不十分明了， 在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不 可预见性大。b、由于吸附法制备的固定化酶酶易脱 落，影响产物纯度和酶的操作稳定性。 2、包理法 包埋法是将载体聚合物的单体与酶溶液混合，再 借助于聚合助进剂（包括交联剂）
4、的作用进行单体 聚合，酶被包埋在载体聚合物中以达到固定化。 分为凝胶包理法和微囊包埋法 凝胶包理法 凝胶包埋法（基质包埋法）是将酶分子包埋在凝 胶网络的格子中。 海藻酸钙凝胶（海藻酸钠）、聚丙烯酰胺凝胶、 淀粉凝胶、卡拉胶 微囊包埋法 微囊包埋法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的 微囊内。此法在医疗上极为有用 人造细胞、红血球包埋法、脂质体包埋法 包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法。 优点：操作简单，条件温和；无反应，不改 变酶的空间结构，固定化酶的活力高；适用性广 。 缺点： 只适宜于小分子底物，对大分子底物不 适宜； 凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化 酶动力学行为的变化。 3、共价结合
5、法（共价偶联法） 就是酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团 之间形成共价键而固定的方法。 优点：酶与载体结合牢固，酶不易脱落。 缺点：但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制 作手续亦较繁琐。 酶分子和载体连接的功能基团 酶分子：-NH3、-COOH、苯环基、 -OH、-SH、 咪唑基、吲哚基 载体：芳香氨基，羧基，羧甲基等 载体的选择 载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体 的一般要求是： a、一般亲水载体都优于疏水载体（结合量、活 力、稳定性） ； b、载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强 度； c、载体必须带有在温和条件与酶共价结合的功 能基团； d、载体没有或很少有非专一性吸附；
6、e、载体来源容易，便宜，并能反复使用。 如:天然高分子衍生物: 纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 性能好，但有疏水结构 尼龙 偶联反应 有13类反应，但必须考虑偶联效率，固定化酶总 活力，操作简便以及成本等因素。 常用的偶联反应：重氮化法、叠氮法、溴化氰法 、芳香烃化法等。 a、重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸 酸处理成重氮盐衍生物，再在偏碱(pH8-9)条件下与 酶蛋白的氨基、酚基、咪唑基发生偶联反应，得到 固定化酶。 多糖类的芳香族氨基衍生物载体 （对-硫酸脂乙砜基胺多糖） 氨基酸共聚体 如L-Leu和对氨基-DL-
7、苯丙氨酸共聚物 聚丙烯酰胺衍生物 苯乙酰树脂 多孔玻璃的氨基硅烷衍生物 Y-氨基丙基三氧乙烷硅 第一步： 第二步： 对硝基苯酚氯 b、叠氮法 将带有羧基或羟基、羧甲基等的载体在酸性条件 下用甲醇处理使之酯化，再用水合肼处理形成酰肼 ，最后在HNO3作用下转变成叠氮衍生物。在低温 下可与酶蛋白的氨基、羟基、酚基、巯基等反应 羧甲基纤维素、CMSephadex c、溴化氰法 含有羟基的载体（如纤维素、葡聚糖、琼脂等 ）在碱性条件下，载体的羟基与CNBr反应，生成 活泼的亚胺碳酸盐，在弱碱条件下，可与酶分子的 氨基偶联，产生固定化酶。 d、芳香烃化法 具有羟基的载体可以通过烷基化、芳香基化引入 活泼
8、的卤素基后，在碱性条件下，与酶分子上的氨 基、酚基、巯基等反应。 纤维素载体 均三氯三嗪 3-F-4，6-二硝基苯 4、交联法 利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与惰 性蛋白间进行交联反应制备固定化酶。 最常用的交联试剂是戊二醛，其他如苯基二异 硫氰、双重氮联苯胺-2，2-二磺酸、1，5-二氟-2， 4-二硝苯、己二酰二胺二甲脂等。 戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨 基反应，使酶蛋白交联。 缺点： 反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶 活力损失大。 制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。 各种固定化方法的比较 交联法常与吸附法、包埋法结合使用。 第二节 固定化酶的性质 由于固
9、定的方法不同，固定化酶的活力和性质也 有所不同。 一、固定化酶的活力下降 原因：酶的结构或构象发生变化(特别是酶活 性中心)；酶与底物间的相互作用受到空间位阻(屏 蔽效应)；微环境影响；底物、产物的分配不均 效应；底物、产物的扩散限制效应 活力测定、偶联效率、活力回收、相对活力 二、固定化酶的稳定性提高 原因： 固定化增加了酶活性构象的牢固程度， 可防止酶分子伸展变形； 抑制蛋白酶降解； 固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。 但如果固定化触及到酶稳定性区域，也可能导致 酶稳定性下降。 1、热稳定性提高 氨基酰化酶：溶液酶在75保温15min，活力为0 ；DEAE-Sephadex固定化酶在
10、同样条件下仍有80； DEAE-纤维素固定化酶在同样条件下还有60活力 。 2、对蛋白酶的抵抗力提高 氨基酰化酶：在胰蛋白酶作用下活力仅存20， 而将其固定于DEAE纤维素上在同样条件下仍有80 的活力。 3、对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高 氨基酰化酶：溶液酶在6mol、2mol弧、1 SDS 和4mmol丙酮溶液中相对活力分别为 9、49、1 和55，而后者在相应溶液中相对活力则分别为 146%、117%、35%和138%。 4、操作稳定性提高 固定化酶在操作中可以长期使用，半衰期较长。 青霉素酰化酶：37 催化77天，活力仍为100% 5、贮藏稳定性提高 木瓜蛋白酶：在4下，120天溶液酶
11、活力只保留 有70%，而固定化酶（琼脂）活力无变化。 三、固定化酶的催化特性改变 1、最适温度 固定化酶反应的温度一般较溶液酶的高，如用 CM-纤维素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度 比溶液酶高515。 （但也有例外） 2、最适pH 最适pH的变动依据载体的电荷性质而定。 带负电荷载体：最适pH 向碱性偏移。 带正电荷载体：最适pH 向酸性偏移。 DEAE-纤维素或DEAE-葡聚糖固定化氨基酰化酶 与其游离酶比较，低0.5个pH而偏向酸性方向。CM- 纤维素固定化的胰蛋白酶、糜蛋白酶的最适pH与游 离酶比较，向碱性方向偏移0.51个pH单位。 3、Km（反应动力学） 多数固定化酶的Km有一定
12、变化，与活性中心的 构象改变及载体的电荷性质有关。 载体与底物电荷相反，固定化酶的Km值降低。 载体与底物电荷相同，固定化酶的Km值显著增加 。 4、专一性 大多数固定化酶的专一性与溶液酶相同，但也有 例外。 第六章 酶(蛋白质)分子的化学修饰 （蛋白质水平的分子改造） 酶分子的化学修饰就是在体外通过人工的方法将 酶分子与一些化学基团或化学物质(修饰试剂 )进行共 价连接从而改变酶的结构和性质。 基础研究：探测酶活性必需氨基酸的性质和数 目；探测酶蛋白的结构变化与功能的关系；测 定酶蛋白部分区域的构象状态；探索酶的作用机 理和催化反应历程；研究酶的固定化技术。 应用研究： 提高酶的稳定性； 改
13、善酶的催 化特性；提高蛋白药物在体内不稳性、 消除免疫 原性及靶向性（病灶细胞）。 第一节 酶化学修饰的基本条件 必须对被修饰酶的性质、修饰原理、修饰剂和 反应条件等方面有足够的了解 一、被修饰酶的性质 1、基本性质 热、酸碱稳定性，最适温度、pH，pI，抑制剂， 蛋白酶水解部位等。 2、酶活性中心 氨基酸残基数目、性质及其地位、有无辅助因子 及种类。 3、被修饰氨基酸侧链基团的性质及反应性 常被修饰的侧链基团：巯基、氨基、羧基、咪 唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫 键等 巯基的修饰试剂 烷基化试剂：碘乙酸、碘乙酸胺、巯基乙醇、 谷胱甘肽 汞试剂：HgCl2、对氯汞苯甲酸、2-氯汞
14、硝基苯 酚 Ellman试剂：5，5-二硫-二-2-硝基苯甲酸 氨基的修饰试剂 乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟 苯、苯异硫氰酸酯、碘乙酸 羧基的修饰试剂 甲醇、硼氟化三甲锌盐（-COOCH3） 咪唑基的修饰试剂 碘乙酸、碘乙酸胺 吲哚基的修饰试剂 光敏试剂（打开吲哚环）、4-硝基苯硫氯 甲硫氨酸侧链基团的修饰试剂 碘代乙酰胺、H2O2或光敏试剂(E-S-CH3的硫氧 化) 二硫键的修饰试剂 二硫苏糖醇、2-巯基乙醇 酚基的修饰试剂 N-乙酰咪唑、二异丙基氟磷酸 胍基的修饰试剂 丁二酮、苯乙二醛（结合在胍基的两个氨基上） 二、修饰反应的条件 酶稳定、修饰率高、活力回收高(实验探索确定) 1、pH与离子强度 决定了侧链基团的解离状态和反应性能 有些修饰试剂在不同pH条件下与同一基团可形 成不同产物。 2、修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专 一性的修饰反应。 3、反应体系中酶与修饰剂的比例 第二节 酶化学修饰的方法 酶表面修饰、酶内部修饰 金属离子置换修饰, 大分子修饰(共价/非共价) 侧链基
