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1、二、 转录水平的调控,1. 转录调控的原理 2. 原核生物转录调控的操纵子学说 乳糖操纵子与负控诱导系统 色氨酸操纵子与负控阻遏系统 其他操纵子 转录水平上的其他调控方式,4. 色氨酸操纵子(trp operon),trp体系参与生物合成，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的调控。 色氨酸合成主要分5步完成，有7个基因参与整个合成过程。 操纵子中各基因功能： trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶， trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶， trpF编码异构酶， trpC编码吲哚甘油磷酸合酶， trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的和亚基。 在许多细菌中，trpE和trpG，trpC和trpB分
2、别融合成一个基因，产生具有双重功能的蛋白质。,分枝酸先在邻氨基苯甲酸合成酶作用下生成邻氨基苯甲酸，此后先与磷酸核糖焦磷酸中的磷酸核糖形成磷酸核糖邻氨基苯甲酸，经重排、脱羧和关环形成吲哚甘油磷酸，然后在色氨酸合成酶催化下先脱去3-磷酸甘油醛生成吲哚，最后吲哚与一个丝氨酸缩合形成色氨酸。,E.Coli中Trp操纵子的结构 5个色氨酸合成代谢相关酶的基因构成一个操纵子。 合成Trp所需要酶类的5个基因E、D、C、B、A头尾相接串连排列组成结构基因群；受其上游的启动子P和操纵子O的调控。 这些基因只有在缺乏Trp时，才被有效表达。,trp操纵子,基因产物是5个酶，分别是邻氨基苯甲酸合成酶(E)、邻氨基
3、苯甲酸磷酸核糖转移酶(D)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶-吲哚甘油磷酸合成酶(C)、 色氨酸合成酶 (B)和色氨酸合成酶 (A)。,色氨酸操纵元的调控机制,trp操纵元属阻遏型操纵元，主要调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成。,色氨酸操纵子通常处于开放状态，其辅阻遏蛋白不能与操纵基因结合而阻遏转录。而当色氨酸合成过多时，色氨酸作为辅阻遏物与辅阻遏蛋白结合而形成阻遏蛋白，后者与操纵基因结合而使基因转录关闭。,4.1 辅阻遏蛋白的负调控,与lac操纵子的调控不同的是，控制Trp操纵子的阻遏蛋白的效应物（ Trp ）不是一个诱导物（inducer）, 而是一个辅阻遏物（corepressor
4、）。也就是说，Trp操纵子的调节基因的产物（阻遏物蛋白）无活性，不能与操纵基因结合；当Trp存在时，它与阻遏物蛋白结合，诱导该蛋白构象变化，能够结合在操纵基因上并阻止转录。,调控基因trpR的位置远离P-O-结构基因群，在其自身的启动子作用下，以组成型方式低水平表达调控蛋白R；R并无活性。 当提供足够的Trp时，Trp与R结合使其构象改变而成为活性形式R，R可与操纵基因O特异性结合，阻遏结构基因的转录，R的阻遏能力仅为lac I产物的1/1000。,trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体图上25分钟处，而前者则位于90分钟处。在位于65分钟处
5、还有一个trpS（色氨酸tRNA合成酶），它与携带有色氨酸的tRNATrp共同参与trp操纵子的调控作用。,trpS (色氨酰tRNA合成酶),trpa,当有足够的Trp时，操纵子自动关闭。细菌直接利用外界的Trp。 缺乏Trp时，Trp操纵子被打开，5个结构基因表达，产生3个酶催化分支酸合成为Trp。,这是一种负性调控，操纵子通常是开放转录的。当有效应物(Trp)作用时，诱导使阻遏蛋白R构象发生变化，能够结合于操纵基因，则阻遏转录。,4.2 色氨酸操纵子的衰减调控,研究表明色氨酸操纵子存在两种机制的调控。如果trp操纵子只受trpR编码的阻遏物调控，那么在缺乏或存在色氨酸时，trpR突变使t
6、rp操纵子表达的酶量应该是相同的。可是，在trpR缺失突变体中，培养基中缺乏色氨酸比有色氨酸存在时操纵子的表达水平更高，说明色氨酸操纵子除受阻遏物调控外，还受另一机制的调控。,4.2.1 弱化子与前导肽,当阻遏物对trp操纵子的阻遏作用被解除，但细胞内仍有一定浓度的色氨酸时，第二种调控机制使trp操纵子的转录在抵达trpE之前被提前终止，这种现象称为弱化作用（attenuation），DNA中导致mRNA合成提前终止的一段序列称为弱化子（attenuator）。弱化作用产生的关键在于trp mRNA的前导区。,在Trp操纵子Ptrp-O与trpE间有一段162bp的先导序列(leading s
7、equence, L)。在L内有一段123150bp的序列，它在转录起始后可调控转录过程的进行。 这段碱基序列如果缺失，trp基因表达可提高6-10倍。mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录。这个区域被称为弱化子，该区mRNA可通过自我配对形成茎-环结构。,弱化子的共同特点是某些外部因素控制着弱化子的发夹形成。即形成终止子结构。弱化子为结构基因的转录设了一道关卡。,前导肽 分析前导序列发现，它包括起始密码子AUG和终止密码子UGA，能产生一个含有14个氨基酸的多肽，这个假设的多肽被称为前导肽。 在前导
8、序列的第10和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。组氨酸操纵子含有7个相邻的组氨酸密码子，苯丙氨酸操纵子也有7个苯丙氨酸密码子，这些密码子参与了操纵子中的转录弱化机制。,先导序列包括起始密码子AUG和终止密码子UGA，它编码了一个14个AA的先导肽。编码先导肽的第10、11位是相邻的两个Trp密码子。,先导序列含有3对反向重复序列(A=1+2；B=2+3；C=3+4)。,如果B(2+3)形成发夹结构，A和C都不能再形成发夹结构。,当A（1+2）形成发夹结构时，B就不能形成发夹结构，却有利于C（3+4）生成发夹结构。,B,C后是poly(U)，即C实际是一个终止子，如果转录mRNA时它形成发夹结
9、构，就能使RNA聚合酶停止转录而从mRNA上脱离下来。,mRNA前导区的序列分析 trp前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中4个分别以1、2、3和4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3方式互补配对。,终止构型,抗终止构型,无色氨酸时操纵子基因开始转录，此后转录速率受转录弱化机制(attenuation)调节。在结构基因与 O 之间有一衰减子区域 ，该区域含有4段特殊的序列，高浓度色氨酸时能形成不依赖因子的转录终止信号，RNA聚合酶脱落，转录终止。低浓度色氨酸时则不能形成转录终止信号，转录继续。,4.2.2 弱化子的负调控,原核生物转录和翻
10、译几乎同时进行，在Trp未达到能起阻遏作用的浓度时，从Ptrp起始转录，RNA聚合酶沿DNA转录合成mRNA，同时核糖体结合在mRNA上开始翻译。 当Trp水平高时，已经起始了转录的RNA聚合酶在特定的位点暂停，接着在到达trp E之前终止。 但当Trp缺乏时，聚合酶不终止，而是通读trp基因。 Trp合成酶类的量与Trp浓度呈负相关，这种调控现象与Trp操纵子特殊的结构有关。,Trp浓度低时，生成Trp-tRNAtrp量少，使核糖体停止在mRNA上的Trp密码子UGG处；使A（1与2）不能形成发夹结构；而2+3形成发夹结构，阻止了3+4生成终止子；RNA pol可沿DNA继续转录，trp操纵
11、子就处于开放状态。,Trp浓度高时，trp-tRNAtrp浓度随之升高，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前就到达2区，使2+3不能配对，而3+4区可以自由配对形成茎-环状终止子结构，转录停止，结构基因被关闭而不再合成色氨酸。,Trp的存在对终止转录是有效的，弱化子仅允许约10%的RNA聚合酶通过。 缺乏Trp时，弱化子允许所有的聚合酶通过。,当所有的氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据A的序列，结果有利于1+2和3+4发夹结构的形成，于是RNA pol停止转录。,色氨酸操纵子代表了一种衰减调控模式,在trp操纵子上，弱化子的转录终止作用取决于色氨酸的浓
12、度。a. 高色氨酸条件下，序列3和4配对，形成转录终止发夹。b. 低色氨酸条件下，核糖体停在色氨酸密码子附近，序列1被核糖体覆盖，序列2和3配对，因此阻止了3、4之间形成转录终止发夹。c 没有蛋白合成时，如果没有核糖体起始先导肽的翻译，序列1、2形成发夹，阻止了2、3发夹的形成，允许序列3、4形成转录终止发夹，酶不表达。,实验证据,转录弱化理论得到了大量实验证据的支持：（1）影响区段3和区段4二级结构稳定性的突变以及改变区段4后面一串U的突变都会降低弱化子的终止作用，增加trp操纵子的表达，这与终止子的突变效应是一样的；（2）相反，影响影响区段2和3配对的突变，则增加弱化子的弱化作用；（3）如
13、果前导肽的起始密码子发生错义突变，前导肽的翻译就不能起始，有利于前导RNA形成12、34二级结构，则转录必定在弱化子处终止。,有实验证明，在不加色氨酸的培养基中，trp mRNA的合成仍然受到部分阻遏，现在一般认为，野生型细胞中同时存在着有活性和无活性的阻遏物，培养基中色氨酸浓度的变化，能够使这两种阻遏物间的平衡发生倾斜，最终做出关闭或启动trp操纵子的决定，从而维持一定的色氨酸含量。,4.2.3 阻遏与弱化作用的协调,细菌中为什么需要弱化子系统呢？ 一种可能是阻遏物从有活性向无活性的转变速度较慢，需要一个能更快地做出反应的系统，以保持培养基中适当的色氨酸水平。或者，弱化子系统主要是对外源色氨
14、酸浓度做出反应。外源色氨酸浓度很低的信号虽然足以引起trp操纵子的去阻遏作用，但是这个信号还不足以很快引发内源色氨酸的合成。在这种环境下，弱化子就通过抗终止的方法来增加trp基因表达，从而提高内源色氨酸浓度。,那么为什么还要有阻遏体系呢？ 没有阻遏体系，只有弱化，似乎也可以调节色氨酸酶系的合成。目前认为阻遏物的作用是当有大量外源色氨酸存在时，阻止非必需的先导mRNA的合成，它使这个合成系统更加经济。 事实上，自然界存在着不同类型的合成体系，例如组氨酸操纵子拥有在功能上与trp操纵子完全相同的弱化子结构，但没有阻遏物，它的表达完全受弱化子调节。,在trp操纵子中，阻遏蛋白的负调控起到粗调的作用，
15、而衰减子起到细调的作用。 细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，而对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停顿下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少，弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少，通过前导肽的翻译来控制转录的进行。 细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体内周密的调控作用。,5. 其他操纵子,5.1 半乳糖操纵子 (galactose operon),Galactose operon包括3个结构基因（gal E、gal T、gal k）表达产生的异构酶(UDP-galactose-4-epimerase)、半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(
16、galactose transferase)和半乳糖激酶(galactose kinase)参与Gal代谢，形成UDPGal，用于合成细胞壁。,5.1.1 半乳糖操纵子的结构及特点,当细胞中缺乏葡萄糖时，这些酶可使Gal转变成G-1-P，供细菌生命活动需要。,gal操纵子属于诱导型操纵子。调节基因galR距离结构基因galE、T、K及操纵区O等很远，而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同。Gal是gal操纵子的诱导物。Gal的跨膜运输需要galP基因产物的参与。,gal操纵子的特点： 它有两个启动子，相距仅5bp,每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2。其mRNA可从两个不同的起始点开始转录； 有两个O区，一个在P区上游-6753（OE），一个在结构基因galE内部（OI）。 cAMP-CAP位点在-24-50之间。,gal操纵子有两个相互重叠的启动子，可从两个不同的起始点（S1、S2）开始转录；,gal操纵子有两个O区，一个在P区上游-6753，另一个在结构基因galE内部。,gal P
