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1、第六章第六章 高效液相色谱法高效液相色谱法一、一、HPLC与与经典典LC区区别二、二、HPLC与与GC差差别三、特点三、特点高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。一、一、HPLC与与经典典LC区区别主要区主要区别：固定相、：固定相、输液液设备和和检测手段手段1经典典LC：仅做做为一种分离手段一种分离手段 柱内径柱内径13cm，固定相粒径，固定相粒径100m 且不均匀且不均匀 柱效低柱效低H，n） 常常压输送流送流动相相 分析周期分析周期长 无法在无法在线检测2H
2、PLC：分离和分析：分离和分析 柱内径柱内径26mm，固定相粒径，固定相粒径 流动相极性流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱；极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱； 适于分离极性组分。适于分离极性组分。 反相色谱：固定液极性反相色谱：固定液极性 流动相极性流动相极性 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱；极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱； 适于分离非极性组分。适于分离非极性组分。3、流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动、流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性正相）；相，即流动相的极性小于固定液的极性正相）；反之，流动相的极性大于固
3、定液的极性反相）。反之，流动相的极性大于固定液的极性反相）。4、固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少、固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用。采用。5、运用：既能分离极性化合物，又能分离非极性、运用：既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物。化合物。三、键合相色谱利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面分类：分类：反相键合相色谱：键合固定相极性反相键合相色谱：键合固定相极性 流动相极性流动相极性 （一反相键合相色谱（一反相键合相色谱1、基本原理：疏溶、基本原理：疏溶剂理理论 键合在硅胶表面的非极性或弱极性基合在硅胶表面的非极性或弱极性基团具
4、有具有较强的疏水特性，当用极性溶的疏水特性，当用极性溶剂为流流动相来分离含有相来分离含有极性官能极性官能团的有机化合物的有机化合物时：一方面，分子中的：一方面，分子中的非极性部分与疏水基非极性部分与疏水基团产生生缔合作用，使它保留合作用，使它保留在固定相中；另一方面，被分离物的极性部分受在固定相中；另一方面，被分离物的极性部分受到极性流到极性流动相的作用，使它离开固定相，并减小相的作用，使它离开固定相，并减小保留作用。保留作用。2、固定相：非极性、固定相：非极性烷基基键合相合相 C8柱，柱，C18柱柱ODS柱柱HPLC约80%问题）3、流动相：极性大、流动相：极性大 流动相极性流动相极性 固定
5、相极性固定相极性 底剂底剂 + 有机调节剂极性调节剂）有机调节剂极性调节剂） 例：水例：水 + 甲醇，乙腈，甲醇，乙腈，THF4、出柱顺序：极性大的组分先出柱、出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱极性小的组分后出柱5、适用：非极性、适用：非极性中等极性组分中等极性组分HPLC80%问题）问题）（二正相（二正相键合相色合相色谱1、基本原理：利用、基本原理：利用组分在两相中溶解度的差异。分在两相中溶解度的差异。2固定相：极性大的固定相：极性大的氰基或氨基基或氨基键合相合相3流流动相：极性小相：极性小 流流动相极性相极性 固定相极性固定相极性 底底剂 + 有机极性有机极性调节剂 例：正己
6、例：正己烷 + 氯仿仿-甲醇，甲醇，氯仿仿-乙醇乙醇4、出柱顺序：极性小的组分先出柱、出柱顺序：极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱极性大的组分后出柱5、适用：用于分离各类极性化合物。、适用：用于分离各类极性化合物。氰基键合相与硅胶的柱选择性相似极性稍小）氰基键合相与硅胶的柱选择性相似极性稍小） 分离极性稍小的物质分离极性稍小的物质氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等分析极性大物质、糖类等四、凝胶色谱分子排阻色谱法）1、基本原理：按分子大小分离。、基本原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，
7、出峰最慢；中等分子只能中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。剂分子小，故在最后出峰。2、固定相：采用凝胶。、固定相：采用凝胶。 凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。孔径的多聚体的通称。 如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。苯乙烯凝胶等硬质凝胶。3、流动相、流动相 必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这必须能溶解
8、样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。样才能润湿凝胶。五、离子交换色谱1、基本原理：利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实、基本原理：利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。现分离的。阴离子交换： 一般形式： R一AB RBA阳离子交换：当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：2、固定相：、固定相：作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基
9、的离解度大小还有强弱之分阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分3、流动相、流动相 离子交换色谱法所用流动相大都是一定离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓和盐浓度或离子强度的缓冲溶液。度或离子强度的缓冲溶液。 通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控值可控制制k值，改变选择性。值，改变选择性。 如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。六、分离类型的选择 1 1根据相对分子质量选择根据相对分子质量选择 相对分子质
10、量十分低的样品，其挥发性好，相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。适用于气相色谱。 标准液相色谱类型液一固、液一液、离标准液相色谱类型液一固、液一液、离子交换色谱最适合的相对分子质量范围是子交换色谱最适合的相对分子质量范围是20O20O20002000。 对于相对分子质量大于对于相对分子质量大于20002000的样品，则用的样品，则用尺寸排阻法为最佳。尺寸排阻法为最佳。 2 2根据溶解度选择根据溶解度选择 弄弄清清样样品品在在水水、异异辛辛烷烷、苯苯、四四氯氯化化碳碳、异异丙丙醇醇中的溶解度是很有用的。中的溶解度是很有用的。 如如果果样样品品可可溶溶于于水水并并属属于于能能离离
11、解解物物质质，以以采采用用离离子交换色谱为佳；子交换色谱为佳； 如如样样品品可可溶溶于于烃烃类类如如苯苯或或异异辛辛烷烷），则则可可采采用用液一固吸附色谱；液一固吸附色谱； 如如样样品品溶溶解解于于四四氯氯化化碳碳，则则多多采采用用常常规规的的分分配和吸附色谱分离；配和吸附色谱分离； 如如样样品品既既溶溶于于水水又又溶溶于于异异丙丙醇醇时时，常常用用水水和和异异丙丙醇醇的的混混合合液液作作液液一一液液分分配配色色谱谱的的流流动动相相，以以憎憎水性化合物作固定相。水性化合物作固定相。3 3根据分子结构选择根据分子结构选择 用用红红外外光光谱谱法法，可可预预先先简简单单地地判判断断样样品品中中存存
12、在在什什么么官官能能团团。然然后后，确确定定采采用用什什么么方方法法合合适适。例例如如，酸酸、碱碱化化合合物物用用离离子子交交换换色色谱谱；脂脂肪肪族族或或芳芳香香族族用用液液一一液液分分配配色色谱谱、液液一一固固吸吸附附色色谱谱；异异构构体体用用液液一一固固吸吸附附色色谱谱；同同系系物物不不同官能团及强氢键的用液一液分配色谱。同官能团及强氢键的用液一液分配色谱。 现列出表作为选择分离类型的参考。现列出表作为选择分离类型的参考。 表 液相色谱分离类型选择参考表 溶于水排阻色谱，水为流动相 相对分子质量 2000 不溶于水排阻色谱，非水流动相 同系物分配色谱 不溶于水 异构体吸附色谱样品 分子大
13、小差异排阻色谱 反相液一液色谱 相对分子质量 溶于水，不离解 2000 排阻色谱，水为流动相 碱阳离子交换色谱 溶于水，可离解 酸阴离子交换色谱 溶于水， 离子与非离子反相离子对色谱 第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪（high performance liquid high performance liquid chromatographchromatograph，HPLCHPLC）液相色谱仪液相色谱仪1）一、仪器工作流程一、仪器工作流程高压输液系统高压输液系统色谱柱系统色谱柱系统（数据记录处理系统工作站（数据记录处理系统工作站进样系统进样系统检测系统检测系统HPLC的仪器配置及流程
14、色色色色谱泵谱泵自自自自动进样动进样器器器器色色色色谱谱柱及柱温箱柱及柱温箱柱及柱温箱柱及柱温箱检测检测器器器器数据数据数据数据处处理系理系理系理系统统溶溶溶溶剂剂二、主要部件二、主要部件（一高压输液系统（一高压输液系统1、 贮贮液器液器（1 作用：提供足作用：提供足够够数量的符合要求的流数量的符合要求的流动动相以完相以完成分析工作。成分析工作。（2 要求：要求：必必须须有足有足够够的容的容积积，以，以备备重复分析重复分析时时保保证证供液；供液；脱气方便；脱气方便；能耐一定能耐一定压压力；力；所所用的材用的材质对质对所使用的溶所使用的溶剂剂都是惰性的。都是惰性的。 2、 高高压输压输液液泵泵
15、关关键键部件之一。部件之一。（1 作用：将流作用：将流动动相以相以稳稳定的流速或定的流速或压压力力输输送到色送到色谱谱分分离系离系统统。（2 要求：要求： 泵泵体材料能耐化学腐体材料能耐化学腐蚀蚀；能在高能在高压压 3060MPa 下下连续连续工作；工作；输输出流量出流量稳稳定（定（ 1%），无），无脉冲，重复性高（脉冲，重复性高（ 0.5%） ，而且，而且输输出流量范出流量范围宽围宽；适用于梯度洗脱。适用于梯度洗脱。（3 类类型：恒型：恒压泵压泵、恒流、恒流泵泵。输液泵操作注意事项：输液泵操作注意事项：防止固体微粒进入泵体防止固体微粒进入泵体流动相不应含有腐蚀性物质流动相不应含有腐蚀性物质防
16、止溶剂瓶内的流动相被用完防止溶剂瓶内的流动相被用完不超过规定的最高压力不超过规定的最高压力流动相一般应该先脱气流动相一般应该先脱气3、过滤器、过滤器（1作用：除杂质。作用：除杂质。（2类型：类型： 溶剂过滤器、管道过滤器。溶剂过滤器、管道过滤器。 4、梯度淋洗装置、梯度淋洗装置（1作用：缩短时间，使各组分完全分离。作用：缩短时间，使各组分完全分离。（2类型：型：高高压梯度：利用两台高梯度：利用两台高压输液液泵，将两种不同极，将两种不同极性的溶性的溶剂按一定的比例送按一定的比例送入梯度混合室，混合后入梯度混合室，混合后进入色入色谱柱。柱。低低压梯度：一台高梯度：一台高压泵, 通通过比例比例调节阀
17、，将两种，将两种或多种不同极性的溶或多种不同极性的溶剂按按一定的比例抽入高一定的比例抽入高压泵中中混合。混合。流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。（二）（二） 进样系统进样系统 （三色谱柱系统（三色谱柱系统柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。（四检测器系统（四检测器系统1、紫外检测器、紫外检测器 应用最广，对大部分有机化应用最广，对大部分有机化合物有响应。合物有响应。适于：吸收紫外光的物适于：吸收紫外光的物质。特点：灵敏度高；特点：灵敏度高； 线形范形范围高；高； 流通池可做的很小流通池可做的很小1mm10mm，容，
18、容积 8L）；）； 对流流动相的流速和温度相的流速和温度变化不敏感；化不敏感； 波波长可可选，易于操作；，易于操作； 可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。 2、光电二极管阵列检测器、光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如下图。波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如下图。光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 原理：每种物质具有不同的原理：每种物质具有不同的折光指数。可连续检测参比折光指数。可连续检测参比池和样品池中流动相之间的池和
19、样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度折光指数差值，差值与浓度呈正比。呈正比。特点：灵敏度低、对温度敏特点：灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种。转式、反射式和干涉型三种。3、示差折光检测器、示差折光检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器。除紫外检测器之外应用最多的检测器。4、荧光检测器、荧光检测器适于：只能分析自身发光适于：只能分析自身发光的物质。的物质。特点：高灵敏度、高选择特点：高灵敏度、高选择性。性。 对多环芳烃，维生素对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾农药、药物、氨
20、基酸、甾类化合物等有响应。类化合物等有响应。（五色谱工作站（五色谱工作站操作步骤1)观察流动相流路;2)开电源开关；3)启动泵; 4) 设定压力上、下限;5) 设定分析流速及压力上下限；三、高效液相色谱仪的使用三、高效液相色谱仪的使用设定流速及压力上设定流速及压力上/下限下限 泵启动停止键电源开关输入信息6) 设定波长;检测电源开关波长设定键零点调节键输入信息7)将进样阀手柄上下扳动几次，最后停在INJECT(采样)位置；8)进样分析;9)记录数据与数据处理;10)分析结束后停泵，将进样阀手柄置LOAD位置； 11)停泵；12)关闭电源开关第三节第三节 高效液相色谱的基本理论高效液相色谱的基本
21、理论和实验技术和实验技术一、速率理论一、速率理论 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/u较小，可以忽略不计，即： H=A+ B/u + Cu1液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。2采用粒度小、填充均匀固定相可提高柱效。3液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质，恒温。4采用粘度小、低流速的流动相可降低传质阻力项，提高柱效。二、实验技术二、实验技术1、溶、溶剂处理技理技术 （1溶溶剂的的纯化化 色色谱纯、分析、分析纯 方法：吸附、蒸方法：吸附、蒸馏、萃取、干燥等。、萃取、干燥等。 （2流流动相的脱气相的脱气
22、 方法：超声波振方法：超声波振荡脱气、惰性气体鼓泡吹脱气、惰性气体鼓泡吹扫脱气、脱气、在在线真空脱气装置等。真空脱气装置等。（3流流动相的相的过滤 方法：方法：0.45m微孔微孔滤膜膜过滤2、色谱柱的制备、色谱柱的制备 （1干法干法 （2匀浆填充法匀浆填充法3、梯度洗脱技术、梯度洗脱技术 改进复杂样品的分离，改善峰形，减少脱尾，缩短分改进复杂样品的分离，改善峰形，减少脱尾，缩短分析时间。析时间。 70%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶剂溶剂( (流动相流动相) )组成对色谱分离的影响组成对色谱分离的影响( (梯度淋洗梯
23、度淋洗) )1 1：9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；2 2：2-2-甲基甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；3 3：2-2-乙基乙基-9,10-9,10-蒽醌蒽醌4 4：1,4-1,4-二甲基二甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；5 5：2-2-特丁基甲基特丁基甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；改变组成使 k 最正确色色谱分离中的分离中的问题 由于分析物由于分析物组成复成复杂，以某一，以某一组成的流成的流动相可能使部相可能使部分待分待测物得到好的分离，但同物得到好的分离，但同时又使其它待又使其它待测物的分离不物的分离不令人令人满意！意！实际工作中采用程序升温工作中采用程序升温GC和梯度
24、淋洗和梯度淋洗LC来解决来解决这个个问题。4、衍生化技术、衍生化技术 紫外紫外-可见衍生化、荧光衍生化可见衍生化、荧光衍生化5、样品的预处理技术、样品的预处理技术 前处理的必要性。前处理的必要性。 萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单的分离方法，萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单的分离方法，如果用得上，而且还不是很麻烦，就要尽可能多的采用如果用得上，而且还不是很麻烦，就要尽可能多的采用以去掉杂质。以去掉杂质。三、三、HPLCHPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择1、固定相与装柱方法的、固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相粒径小的、分布均匀的球形固定相dp10m） 首首选化
25、学化学键合相，匀合相，匀浆法装柱法装柱2、流、流动相及其流速的相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流粘度小、低流速的流动相相甲醇，甲醇，1ml/min 3、柱温的、柱温的选择： 选室温室温250C左右左右四、定性与定量方法四、定性与定量方法1 1、定性方法、定性方法 （1 1利用已知标准品定性利用已知标准品定性 （2 2利用检测器的选择性定性利用检测器的选择性定性 （3 3利用紫外检测器全波长扫描功能定性利用紫外检测器全波长扫描功能定性2 2、定量方法、定量方法 （1 1归一化法归一化法 （2 2外标法外标法 （3 3内标法内标法五、五、 HPLC HPLC的的应用用 1. 环境中有机境中有机氯农药残留量分析残留量分析 固定相：薄壳型硅胶固定相：薄壳型硅胶(37 50m) 流流动相：正己相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min 色色谱柱：柱：50cm2.5mm(内径内径) 检测器：差示折光器：差示折光检测器器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。2. 2. 稠稠环芳芳烃的分析的分析 稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器
