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1、生化分析生化分析（Biochemical Analysis）生命科学与生物工程生命科学与生物工程罗云敬罗云敬生化分析酶分析法蛋白质分析免疫分析核酸分析氨基酸分析糖的分析生物大分子分离纯化技术课程主要内容：课程主要内容：第一章 酶催化反应，酶法分析的检测技术。第二章 蛋白质的分类及结构，蛋白质分析方法。第三章 免疫分析方法的建立、优化及其应用。第四章 核酸的定量及结构分析, DNA序列测定, 核酸分子杂交分析。第五章 氨基酸的定量和选择性分析。第六章 糖的化学和酶法分析, 糖混合物的分离鉴定。第七章 分光光度和荧光光谱的原理，谱图分析，实验设计技巧。第八章 液相色谱原理及色谱仪的基本装置，关键技
2、术。第九章 主要电泳与离心方法, 操作要领。第八章第八章 酶法分析酶法分析酶及酶催化反应酶及酶催化反应酶法分析的检测技术酶法分析的检测技术酶固定化技术与酶传感器酶固定化技术与酶传感器酶活性测定的应用酶活性测定的应用什么是酶？什么是酶？酶是生活细胞产生的，具有催化作用的蛋白酶是生活细胞产生的，具有催化作用的蛋白质。质。酶是生物体内具有催化活性的，有特殊空间酶是生物体内具有催化活性的，有特殊空间构像的生物大分子，包括蛋白质和核酸。构像的生物大分子，包括蛋白质和核酸。酶是生活细胞产生的以蛋白质为主要成分的酶是生活细胞产生的以蛋白质为主要成分的生物催化剂。生物催化剂。酶的特性酶的特性来源于生物体来源于
3、生物体催化效率高（是化学催化剂的催化效率高（是化学催化剂的10107_7_10101313倍）倍）高度的特异性（底物专一性）高度的特异性（底物专一性）易失活（高温、强酸、强碱、重金属盐及紫易失活（高温、强酸、强碱、重金属盐及紫外线）外线）1、高效性、高效性v酶的催化作用可使反应速度提高酶的催化作用可使反应速度提高1010 10101 1倍。倍。例如：过氧化氢分解例如：过氧化氢分解 2 2H H2 2O O2 2 2H 2H2 2O + OO + O2 2v用用FeFe3+3+催化，效率为催化，效率为6 61010-4-4 mol/molS mol/molS，而用过氧化氢酶催而用过氧化氢酶催化，
4、效率为化，效率为6 610106 6 mol/molSmol/molS。v转换数（转换数（turnover numberturnover number）的概念：每秒钟每个酶分子能的概念：每秒钟每个酶分子能催化底物发生变化的微摩尔数，用催化底物发生变化的微摩尔数，用kcatkcat表示（表示（ mol/Smol/S ）。）。v - -淀粉酶催化淀粉水解，淀粉酶催化淀粉水解，1 1克结晶酶在克结晶酶在6565 C C条件下可催化条件下可催化2 2吨淀粉水解。吨淀粉水解。2、 酶的专一性酶的专一性v酶的专一性：酶的专一性：又称为特异性，是指酶在催化又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物的选择性，
5、即一种酶只能生化反应时对底物的选择性，即一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质。亦即酶作用于某一类或某一种特定的物质。亦即酶只能催化某一类或某一种化学反应只能催化某一类或某一种化学反应。例如：蛋白酶催化蛋白质的水解；淀粉酶催化例如：蛋白酶催化蛋白质的水解；淀粉酶催化淀粉的水解；核酸酶催化核酸的水解。淀粉的水解；核酸酶催化核酸的水解。3、反应条件温和、反应条件温和v酶促反应一般在酶促反应一般在pH 5-8 pH 5-8 水溶液中进行，反应水溶液中进行，反应温度范围为温度范围为20-4020-40 C C 。v高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。
6、酶的失活。4、酶易失活、酶易失活v凡能使蛋白质变性的因素如强酸、强碱高温凡能使蛋白质变性的因素如强酸、强碱高温等条件都能使酶破坏而完全失去活性。所以等条件都能使酶破坏而完全失去活性。所以酶作用一般都要求比较温和的条件如常温、酶作用一般都要求比较温和的条件如常温、常压和接近中性的酸碱度。常压和接近中性的酸碱度。5、酶活力可调节控制、酶活力可调节控制如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。原激活及激素控制等。、某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属离子、某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关有关。1.1 1.1 酶及酶催化反应酶及酶催化反应1
7、.1.1 1.1.1 酶的单位酶的单位酶活力（酶活力（Enzyme ActivityEnzyme Activity）：在一定条件下，单位时间内底在一定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的增加量。物的减少量或产物的增加量。酶的国际单位（酶的国际单位（International UnitInternational Unit，IUIU）：在特定条件下在特定条件下1min1min将将1umol1umol的底物转化为产物所需酶的量。的底物转化为产物所需酶的量。卡特尔（卡特尔（KatalKatal）：1Katal1Katal为为1s1s内将内将1mol1mol底物转化为产物所需底物转化为产物所需酶的量。
8、（酶的量。（1katal=6101katal=6107 7UIUI）酶的比活力（酶的比活力（Specific ActivitySpecific Activity）：每毫克每蛋白所具有的：每毫克每蛋白所具有的催化活性，即催化活性，即IU/mgIU/mg1.1.2 1.1.2 酶催化反应的类型及酶的编号酶催化反应的类型及酶的编号1. 1. 氧化还原酶类氧化还原酶类 Oxidoreductases Oxidoreductases2. 2. 转移酶类转移酶类 Transgerases Transgerases3. 3. 水解酶类水解酶类 Hydrolases Hydrolases4. 4. 裂合酶类裂
9、合酶类 Lyases Lyases5. 5. 异构酶类异构酶类 Isomerases Isomerases6. 6. 连接酶类连接酶类 Ligases Ligases酶的编号酶的编号EC W. X. Y.ZEC W. X. Y.Z酶酶学学委委员员会会催催化化反反应应的的类类型型亚亚类类亚亚亚亚类类系系统统编编号号例：例：醇脱氢酶醇脱氢酶（EC EC 1 1. .1 1. .1 1. .1 1) )ECEC：Enzyme CommissionEnzyme Commission（酶学委员会）（酶学委员会）1 1：氧化还原酶类氧化还原酶类1 1：以以 CHOH CHOH基为供体的酶类基为供体的酶类1
10、 1：代表代表NADNAD或或NADPNADP为受体为受体1 1：同一类酶的顺序编号，与发现的先后一同一类酶的顺序编号，与发现的先后一 致致酶催化反应的特性酶催化反应的特性酶反应与非酶反应酶反应与非酶反应活化活化能能的比较：的比较： 酶对反应的加速是通过酶对反应的加速是通过形形 成酶与底物的复合成酶与底物的复合物以降低反应的活化能物以降低反应的活化能GG而实现的而实现的酶催化反应的特性酶催化反应的特性酶活性中心的化学结构，诱导使底物的化学酶活性中心的化学结构，诱导使底物的化学键变形或极化键变形或极化提高底物基态的能量。提高底物基态的能量。底物与酶的结合部位对底物的固定化作用，底物与酶的结合部位
11、对底物的固定化作用，使底物分子进入酶的活性中心，使得很多反使底物分子进入酶的活性中心，使得很多反应类似于分子内反应（接近效应）应类似于分子内反应（接近效应）提高提高了活性中心的底物有效浓度。了活性中心的底物有效浓度。酶催化反应的特性酶催化反应的特性底物正确而有利的定向，底物反应时键只最底物正确而有利的定向，底物反应时键只最小程度的移动或旋转，电荷分布和有利的几小程度的移动或旋转，电荷分布和有利的几何形状何形状降低反应所需活化能。降低反应所需活化能。多功能基团间的协同催化作用多功能基团间的协同催化作用酶活性中心的特点酶活性中心的特点概念概念： 酶结合底物（辅基）以及提供直接参与键形成酶结合底物（
12、辅基）以及提供直接参与键形成和断裂的残基的区域。和断裂的残基的区域。特点特点：（1）活性部位只占酶整体的一小部分，即每分）活性部位只占酶整体的一小部分，即每分子中大多数残基并不与底物接触。子中大多数残基并不与底物接触。（2）酶的活性部位是一个三维实体，由来自氨）酶的活性部位是一个三维实体，由来自氨基酸序列上的不同部位的残基所组成基酸序列上的不同部位的残基所组成酶活性中心的特点酶活性中心的特点（3）酶的三维活性中心是裂缝或裂隙，常是一酶的三维活性中心是裂缝或裂隙，常是一个疏水的环境，底物就存在于这样的环境中。个疏水的环境，底物就存在于这样的环境中。（4）底物与酶之间是以一种弱的力结合在一起。）底
13、物与酶之间是以一种弱的力结合在一起。（5）结合的专一性取决于活性中心部位中原子）结合的专一性取决于活性中心部位中原子的确定排布方式的确定排布方式诱导契合学说诱导契合学说1.1.4 1.1.4 酶催化反应的动力学酶催化反应的动力学一级反应：一级反应：在低底物浓度时在低底物浓度时, , 反应速度与底物浓度成正比，反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。表现为一级反应特征。 速度速度kk试剂试剂 二级反应：二级反应： 速度速度kk试剂试剂1 1试剂试剂2 2 零级反应：零级反应：当底物浓度达到一定值，反应速度达到最大值当底物浓度达到一定值，反应速度达到最大值（V Vmaxmax），此时再增加底
14、物浓度，反应速度不再增加，表现），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应为零级反应. .k k：反应速率常数：反应速率常数酶反应速度与底物浓度的关系米氏方程米氏方程v ESESPEk1k2k3k4反应初始阶段产物浓度比较小，反应初始阶段产物浓度比较小，假设不发生逆反应假设不发生逆反应酶酶底底物物中中间间产产物物产产物物酶酶当底物浓度较低时，当底物浓度较低时，S km, v=Svmax/kmax,反应速反应速度与底物的浓度成正度与底物的浓度成正比。比。当底物浓度很高时当底物浓度很高时， S E3. SE米氏常数米氏常数km的意义的意义v不同的酶具有不同不同的酶具有不同km值，它是酶
15、的一个重要值，它是酶的一个重要的的特征物理常数特征物理常数。vkm值只是在固定的底物，一定的温度和值只是在固定的底物，一定的温度和pHpH条条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的下具有不同的km值。值。v当当S= S= km时，时，v= vmax/2，因此，因此km在数值上等于当在数值上等于当反应速度为最大反应速度值一半时底物的浓度。反应速度为最大反应速度值一半时底物的浓度。vkm值表示酶与底物之间的亲和程度：值表示酶与底物之间的亲和程度：km值值大大表示亲和程度表示亲和程度小小，酶的催化活性低，酶的催化活性低; ; km值值小小表示亲和程度
16、表示亲和程度大大, ,酶的催化活性高酶的催化活性高k2k3时时k kESES为为ESES复合物的解离常数复合物的解离常数米氏常数的测定改变底物浓度，便可以得到如前图所示曲线，改变底物浓度，便可以得到如前图所示曲线，找出找出v vmaxmax。但是在实验上一般误差较大：双曲但是在实验上一般误差较大：双曲线图型，不易确定。若找不到真正的线图型，不易确定。若找不到真正的v vmaxmax，任何任何对对v vmaxmax的推测，都会反映在由此确定的的推测，都会反映在由此确定的k km m上上Lineweave-BurkLineweave-Burk方程（双倒数方程）方程（双倒数方程）斜率斜率=Km/Vm
17、ax-1/Km1/Vmax其他方程其他方程两边求对数：以v对pS作图，v=vmax/2时，pS=pkm。还可变换为：以S/v对S作图，得一直线，横轴截距为-km，酶催化反应机理酶催化反应机理锁匙学说锁匙学说可以很好的解释酶的特异性，但是将酶看成了刚可以很好的解释酶的特异性，但是将酶看成了刚性分子性分子诱导契合模型诱导契合模型诱导楔合学说的四个要点诱导楔合学说的四个要点A.酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模板板B.底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化（专一性底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化（专一性结合）结合）C.当酶的形状发生变化后，就使得其中的
18、催化基团当酶的形状发生变化后，就使得其中的催化基团形成正确的排列。形成正确的排列。D.在酶反应过程中，酶活性中心构象的变化是可逆在酶反应过程中，酶活性中心构象的变化是可逆的。即酶与底物结合时，产生一种诱导构象，反的。即酶与底物结合时，产生一种诱导构象，反应结束时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来应结束时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来的构象。的构象。酸碱催化酸碱催化在酶促反应中，酶分子的某些功能基团可作在酶促反应中，酶分子的某些功能基团可作为酸或碱通过瞬间向底物提供质子或从底物为酸或碱通过瞬间向底物提供质子或从底物分子抽取质子，相互作用而形成过渡复合物，分子抽取质子，相互作用而形成过渡复合物
19、，使活化能降低，加速反应进行，称作酸碱催使活化能降低，加速反应进行，称作酸碱催化化（acid-base ratalysis）酸碱催化酸碱催化酸酸- -碱催化可分为狭义的酸碱催化可分为狭义的酸- -碱催化和广义的碱催化和广义的酸酸- -碱催化。酶参与的酸碱催化。酶参与的酸- -碱催化反应一般都碱催化反应一般都是广义的酸碱催化方式。是广义的酸碱催化方式。广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质子子, ,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程到降低反应活化能的过程。共价催化共价催化催化剂通过与底物形成反应活性很高
20、的共价催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为应速度的过程，称为共价催化共价催化。酶中参与共价催化的基团主要包括以下酶中参与共价催化的基团主要包括以下亲核亲核基团基团： His His 的咪唑基，的咪唑基，Cys Cys 的硫基，的硫基，Asp Asp 的的羧基，羧基，Ser Ser 的羟基等；的羟基等；亲电子基团亲电子基团：H H+ + 、MgMg2+2+、 Mn Mn2+2+ 、FeFe3+3+某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。也可以
21、参与共价催化作用。1.1.5 1.1.5 影响酶催化反应的因素影响酶催化反应的因素温度温度pHpH值值底物及酶的浓度底物及酶的浓度酶的活化酶的活化酶活性的抑制酶活性的抑制温度温度v一方面是温度升高一方面是温度升高, ,酶酶促反应速度加快。促反应速度加快。v另一方面另一方面, ,温度升高温度升高, ,酶酶的高级结构将发生变化的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降或变性，导致酶活性降低甚至丧失。低甚至丧失。v因此大多数酶都有一个因此大多数酶都有一个最适温度。最适温度。 在最适温在最适温度条件下度条件下, ,反应速度最反应速度最大大注意：注意：A 人体温度（人体温度（3737）不等于最适温度）不等
22、于最适温度B B 国际生物化学联合会最初推荐国际生物化学联合会最初推荐25 25 为酶反应为酶反应的标准温度，后来由于在热的气候环境下很的标准温度，后来由于在热的气候环境下很难控制这一温度，所以将标准温度提高到难控制这一温度，所以将标准温度提高到30 30 酸度（酸度（pHpH值）值）v在一定的在一定的pH pH 下下, , 酶具有最大的酶具有最大的催化活性催化活性, ,通常通常称此称此pH pH 为最适为最适 pHpHv主要影响氨基主要影响氨基酸的侧链解离酸的侧链解离状态和底物分状态和底物分子解离状态子解离状态底物及酶的浓度底物及酶的浓度Vmax=KVmax=K3 3EEEE 酶的活化酶的活
23、化酶按其组成分为两类酶按其组成分为两类：v简单蛋白酶简单蛋白酶：指酶的活性仅仅决定于它的蛋白质结指酶的活性仅仅决定于它的蛋白质结构。如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶。构。如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶。v结合蛋白酶结合蛋白酶：这些酶只有在结合了非蛋白组分（辅这些酶只有在结合了非蛋白组分（辅助因子）后，才表现出酶的活性。主要为一些金属助因子）后，才表现出酶的活性。主要为一些金属离子和有机化合物，如生物素、铁卟啉、离子和有机化合物，如生物素、铁卟啉、ATP等等酶活性的抑制酶活性的抑制降低酶催化反应速度的物质称为酶反应的抑降低酶催化反应速度的物质称为酶反应的抑制剂制剂（Inhibitor） 竞争性抑制
24、 可逆抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制 不可逆抑制 不可逆抑制作用不可逆抑制作用（irreversibleinhibition)irreversibleinhibition)许多毒物和药物就是通过抑制酶的活性来作用的：神经毒剂许多毒物和药物就是通过抑制酶的活性来作用的：神经毒剂对于乙酰胆碱酯酶的抑制对于乙酰胆碱酯酶的抑制抑制剂与酶蛋白中的必需基团以共价形式结合，引起酶的永抑制剂与酶蛋白中的必需基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活久性失活, ,不能用透析或超滤等物理方法除去抑制剂而恢复不能用透析或超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性。酶活性。 专一性不可逆抑制作用专一性不可逆抑制作用：这类抑制
25、剂只作用于与酶活性部位这类抑制剂只作用于与酶活性部位有关的氨基酸残基或一类酶。有关的氨基酸残基或一类酶。 非专一性不可逆抑制作用非专一性不可逆抑制作用：这类抑制剂作用于酶分子上不同这类抑制剂作用于酶分子上不同的基团或作用于几类不同的酶。如：酰化剂酸酐和磺酰氯等的基团或作用于几类不同的酶。如：酰化剂酸酐和磺酰氯等可使酶蛋白的可使酶蛋白的-OH-OH、-SH-SH、-NH-NH2 2等发生酰化。等发生酰化。可逆抑制作用可逆抑制作用 (reversibleinhibition) (reversibleinhibition)抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活
26、性暂时性丧失。抑制剂可以通过活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方透析等方法法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类：类：va.a.竞争性抑制作用竞争性抑制作用vb.b.非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用vC.C.反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用竞争性抑制作用竞争性抑制作用v某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之活性中心结合后，底物
27、被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了外，其结果是酶促反应被抑制了。竟争性抑制通常竟争性抑制通常可以通过增大底可以通过增大底物浓度，即提高物浓度，即提高底物的竞争能力底物的竞争能力来消除。来消除。竟竟争争性性抑抑制制非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用抑制剂与酶活性中心以外的部位结合，因此抑制剂与酶活性中心以外的部位结合，因此既可同游离酶结合，又可同酶底物复合物既可同游离酶结合，又可同酶底物复合物结合，这种作用称非竞争性抑制作用。结合，这种作用称非竞争性抑制作用。非竞争性抑制剂与非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的酶活性中心以外的基团结合。这类抑基团结合。这类抑制作用不会因提高制作用不会因提高
28、底物浓度而减弱底物浓度而减弱非非竟竟争争性性抑抑制制反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用酶只有与底物结合后才与抑制剂结合，从而酶只有与底物结合后才与抑制剂结合，从而导致酶活性下降。这类抑制作用最不重要。导致酶活性下降。这类抑制作用最不重要。1.2 1.2 酶法分析的检测技术酶法分析的检测技术在酶法分析中，被分析的对象可以是酶、底物、底在酶法分析中，被分析的对象可以是酶、底物、底物类似物、酶的活化剂或抑制剂等物类似物、酶的活化剂或抑制剂等凡是可以影响酶催化反应的各种物质都有可能被分凡是可以影响酶催化反应的各种物质都有可能被分析析酶活性检测只能用酶活性检测只能用动力学动力学相关的方法；而对于底物相关的
29、方法；而对于底物可以用动力学方法也可以用可以用动力学方法也可以用平衡法平衡法常用的方法有：初速度法、固定时间分析法、固定常用的方法有：初速度法、固定时间分析法、固定变化分析法、平衡法以及酶偶联分析法等。变化分析法、平衡法以及酶偶联分析法等。酶活性的检测酶活性的检测可以测定酶作用底物浓度的减少或产物的积可以测定酶作用底物浓度的减少或产物的积累。（应该选用哪一个比较方便？）累。（应该选用哪一个比较方便？）通常选用测定产物的增加量，因为产物浓度通常选用测定产物的增加量，因为产物浓度有无到有，由低变高比较容易观察和测定；有无到有，由低变高比较容易观察和测定；而底物浓度通常大大过量，反应过程中浓度而底物
30、浓度通常大大过量，反应过程中浓度变化较小，不易测准。变化较小，不易测准。常用分析方法：常用分析方法：分光光度法分光光度法滴定法滴定法电化学分析法电化学分析法荧光光度法荧光光度法比旋光度法等比旋光度法等 后面详细说明后面详细说明初速度法初速度法酶促反应的初速度最酶促反应的初速度最大，且能保持恒定。大，且能保持恒定。但是恒定的时间一般但是恒定的时间一般很有限，初速度的测很有限，初速度的测定必须在此范围能进定必须在此范围能进行行。并不是所有的酶反应的初速度都与酶的活性成正比。并不是所有的酶反应的初速度都与酶的活性成正比。为了确定这一点，一般可以取三个酶浓度测定反应为了确定这一点，一般可以取三个酶浓度
31、测定反应的初速度。若测定的初速度与酶浓度之间呈线性关的初速度。若测定的初速度与酶浓度之间呈线性关系，则说明所选择的条件是合适的。系，则说明所选择的条件是合适的。为了真实地反映酶的活性，一般要采用过量的底物为了真实地反映酶的活性，一般要采用过量的底物（浓度为（浓度为k km m的的1010倍以上），使所有酶的活性位点都倍以上），使所有酶的活性位点都被饱和。此时，对于底物来说是零级反应，对于酶被饱和。此时，对于底物来说是零级反应，对于酶来说为一级反应。来说为一级反应。固定时间分析法固定时间分析法间隔一定的时间，分几次取出一定体积的反间隔一定的时间，分几次取出一定体积的反应液，使酶终止反应，然后分析
32、产物的生成应液，使酶终止反应，然后分析产物的生成量或底物的消耗量，是最经典的方法。量或底物的消耗量，是最经典的方法。一般用强酸、强碱、三氯乙酸、过氯酸或一般用强酸、强碱、三氯乙酸、过氯酸或SDSSDS使酶失活，也可以用加热的方法终止反应。使酶失活，也可以用加热的方法终止反应。注意：所选的时间段内，酶的活性不能有大注意：所选的时间段内，酶的活性不能有大的变化的变化固定变化分析法固定变化分析法与固定时间法原理相同，但是把酶的活性与与固定时间法原理相同，但是把酶的活性与要产生一定的反应量所需的时间关联起来，要产生一定的反应量所需的时间关联起来，即：酶的活性与产生一定的变化量所需的时即：酶的活性与产生
33、一定的变化量所需的时间成反比。间成反比。对于反应中产生对于反应中产生pHpH变化的体系很有用，可以变化的体系很有用，可以通过电位法方便的进行测定。通过电位法方便的进行测定。偶联法测定酶的活性偶联法测定酶的活性将两个酶偶联起来以获得可被检测的信号将两个酶偶联起来以获得可被检测的信号举例：举例： 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ATP +ATP +ATP +ATP 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖-6-6-6-6-磷酸磷酸磷酸磷酸+ADP+ADP+ADP+ADP这个反应中没有明显的光谱性质的变化，无法对于酶活进行测这个反应中没有明显的光谱性质的变化，无法对于酶活进行测定。但是，葡萄糖定。但是，葡萄糖-6-6-磷
34、酸磷酸+ADP+ADP是葡萄糖是葡萄糖-6-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶（G6PDG6PD）的底物，并在）的底物，并在NADPNADP+ +（辅酶（辅酶）存在下发生第二个）存在下发生第二个酶反应。酶反应。葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖-6-6-6-6-磷酸磷酸磷酸磷酸+ NADP+ NADP+ NADP+ NADP+ + + + 6- 6- 6- 6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸+NADPH+ H+NADPH+ H+NADPH+ H+NADPH+ H+ + + + NADPNADP+ +的最大紫外吸收在的最大紫外吸收在280nm280nm，而，而NADPHNADPH的紫外吸收在的紫外
35、吸收在340nm340nm，可以测定。可以测定。己糖激酶己糖激酶G6PD要求：要求：1.1.两个酶催化反映的条件具有相容性；两个酶催化反映的条件具有相容性；2.2.指示反应在整个反应中是非限速步骤，可以指示反应在整个反应中是非限速步骤，可以通过加大指示酶的用量来达到。通过加大指示酶的用量来达到。3.3.限速步骤限速步骤：一条代谢途径中，反应最慢的那一一条代谢途径中，反应最慢的那一 步步底物的测定底物的测定平衡法：将所有的底物都转变为产物，然后平衡法：将所有的底物都转变为产物，然后测定产物生成的量，又称测定产物生成的量，又称“终点法终点法”。酶循环法：酶循环法： 有些酶反应待测的底物的浓度非常低
36、，采用一有些酶反应待测的底物的浓度非常低，采用一般的方法很难检测到产物的量。但是可以采用酶般的方法很难检测到产物的量。但是可以采用酶循环法使偶联反应中的一种产物积累放大，当反循环法使偶联反应中的一种产物积累放大，当反应进行到一定时间时，设法终止反应，并测定积应进行到一定时间时，设法终止反应，并测定积累的产物，其量的大小直接与主反应中底物的量累的产物，其量的大小直接与主反应中底物的量成正比。成正比。还原型辅酶（NADPH）的定量分析NADPH+NADPH+NADPH+NADPH+氧代戊二酸氧代戊二酸氧代戊二酸氧代戊二酸+NH+NH+NH+NH3 3 3 3 NADP NADP NADP NADP
37、+ + + +L-+L-+L-+L-谷氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸NADPNADPNADPNADP+ + + + + + +葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖-6-6-6-6-磷酸磷酸磷酸磷酸 NADPH+6- NADPH+6- NADPH+6- NADPH+6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸微量的微量的NADPHNADPH在关酸脱氢酶的存在下，与氧代戊二酸的氨反在关酸脱氢酶的存在下，与氧代戊二酸的氨反应生成应生成NADPNADP+ +和谷氨酸，所生成的和谷氨酸，所生成的NADPNADP+ + +参与第二个反应，并参与第二个反应，并使得第一次反应所消耗的底物使得第一次反应所消耗的底物NADP
38、HNADPH得到返回，这样便完成得到返回，这样便完成了第一个循环反应。了第一个循环反应。经过多次循环反应后产物经过多次循环反应后产物6-6-磷酸葡萄糖酸便积累放大，最后磷酸葡萄糖酸便积累放大，最后测定一定时间内所形成的该产物的量，据此可以间接获得测定一定时间内所形成的该产物的量，据此可以间接获得NADPHNADPH量的信息。量的信息。底物的动力学测定法底物的动力学测定法底物在一定浓度范围是可以用动力学方法来底物在一定浓度范围是可以用动力学方法来测定的，但是当浓度较低时，很难测定反映测定的，但是当浓度较低时，很难测定反映的初速度。的初速度。采用偶联反应可以使得反应速度保持，从而采用偶联反应可以使
39、得反应速度保持，从而可以获得精确的反应初速度的数据。可以获得精确的反应初速度的数据。原理是通过循环过程使底物的浓度保持恒定，原理是通过循环过程使底物的浓度保持恒定，因而指示反应的速度也保持恒定，该速度与因而指示反应的速度也保持恒定，该速度与第一个反应中底物的浓度成正比。第一个反应中底物的浓度成正比。微量辅酶微量辅酶（NADNAD+ +）的分析）的分析NADNADNADNAD+ + + + + + +CHCHCHCH3 3 3 3CHCHCHCH2 2 2 2OH CHOH CHOH CHOH CH3 3 3 3CHO+NADH CHO+NADH CHO+NADH CHO+NADH （1 1 1
40、 1）NADH+NADH+NADH+NADH+细胞色素细胞色素细胞色素细胞色素c c c c3+3+3+3+ 细胞色素细胞色素细胞色素细胞色素c c c c2+2+2+2+ + + +NADNADNADNAD+ + + + （2 2）（1 1）式中生成的）式中生成的NADHNADH又参与（又参与（2 2）中的反应，并使）中的反应，并使底物底物NADNAD+ +复原，保证了底物复原，保证了底物NADNADNADNAD+ + + +的浓度恒定不变，的浓度恒定不变，从而方便的测定一个反应的初速度，该速度与底物从而方便的测定一个反应的初速度，该速度与底物NADNADNADNAD+ + + +的浓度呈正
41、比。的浓度呈正比。醇脱氢酶醇脱氢酶细胞色素细胞色素c c还原酶还原酶抑制剂及活化剂的测定抑制剂及活化剂的测定竞争性抑制竞争性抑制底物和抑制剂竞争结合底物和抑制剂竞争结合酶的活性位点酶的活性位点可逆抑制反应完全被抑可逆抑制反应完全被抑制时，初速度见右制时，初速度见右作用结果是作用结果是kmkm的表观值的表观值增加了增加了1+I/kI1+I/kI倍倍k kI I为抑制常数为抑制常数 非竞争性抑制非竞争性抑制抑制剂结合在酶的非活抑制剂结合在酶的非活性中心上，虽然不与底性中心上，虽然不与底物竞争位点，但是会导物竞争位点，但是会导致酶与底物结合率的降致酶与底物结合率的降低。低。随着抑制剂的浓度的增随着抑
42、制剂的浓度的增大，反应的初速度将减大，反应的初速度将减小。小。1.2.4 1.2.4 酶的检测方法酶的检测方法分光光度法及荧光法分光光度法及荧光法电化学法电化学法其他方法其他方法分光光度法分光光度法 利用底物与反应产物在紫外和可见光部分光利用底物与反应产物在紫外和可见光部分光吸收的不同，连续或测定反应一定时间内吸吸收的不同，连续或测定反应一定时间内吸光度的变化。光度的变化。连续测定法连续测定法适合于反应速度较快的体系；而适合于反应速度较快的体系；而固定时间法固定时间法适用于一些反应速度较慢的体系。适用于一些反应速度较慢的体系。许多氧化还原酶都可以根据反应过程中混合许多氧化还原酶都可以根据反应过
43、程中混合物吸光度的变化测定其活性。物吸光度的变化测定其活性。荧光法荧光法 酶反应的产物或底物之一有荧光或二者的荧酶反应的产物或底物之一有荧光或二者的荧光光谱不发生重叠就可以根据荧光的变化来光光谱不发生重叠就可以根据荧光的变化来测定酶的活性。测定酶的活性。由于酶分子中常有酪氨酸和色氨酸，它们具由于酶分子中常有酪氨酸和色氨酸，它们具有紫外吸收及荧光，在底物的选择时要避开有紫外吸收及荧光，在底物的选择时要避开它们的干扰。它们的干扰。电化学法电化学法电位计技术（如电位计技术（如pHpH电极）电极）对对H H浓度发生变化的酶促反应，在实际测定时要加入酸或浓度发生变化的酶促反应，在实际测定时要加入酸或碱以
44、维持溶液的碱以维持溶液的pHpH不变，这样才能使酶的活力不发生变不变，这样才能使酶的活力不发生变化。而加入的酸或碱的速度就代表了酶促反应的速度。化。而加入的酸或碱的速度就代表了酶促反应的速度。极谱法（有氧电极法）极谱法（有氧电极法）有些酶促反应中，由于氧气的生成或消耗，引起溶液中有些酶促反应中，由于氧气的生成或消耗，引起溶液中溶解氧浓度的变化，从而引起电极之间电流大小的变化，溶解氧浓度的变化，从而引起电极之间电流大小的变化，由此可以计算出酶的活力，如葡萄糖氧化酶催化的反应。由此可以计算出酶的活力，如葡萄糖氧化酶催化的反应。比气压法灵敏，同时具有抗污染物干扰的特性比气压法灵敏，同时具有抗污染物干
45、扰的特性其他方法其他方法量气法：量气法：用于反应底物或产物之一是气体的情况用于反应底物或产物之一是气体的情况通过测量反应过程中气相的体积或压力的变化便可以计通过测量反应过程中气相的体积或压力的变化便可以计算出气体的释放或吸收的量。再根据气体的变化和时间算出气体的释放或吸收的量。再根据气体的变化和时间的关系就可以确定酶的活力。的关系就可以确定酶的活力。优点优点：可以连续取得数据，以便了解整个酶促反应过程。：可以连续取得数据，以便了解整个酶促反应过程。缺点缺点：灵敏度和准确度都较低：灵敏度和准确度都较低其他方法其他方法量热法：量热法：用非常灵敏的量热计可以测定酶的反应速度。用非常灵敏的量热计可以测
46、定酶的反应速度。该法灵敏，无干扰该法灵敏，无干扰有些反应的产物还可以与缓冲溶液发生二次反应有些反应的产物还可以与缓冲溶液发生二次反应继续放热，从而增加测定酶活力的灵敏度。继续放热，从而增加测定酶活力的灵敏度。1.3 1.3 酶固定化技术与酶传感器酶固定化技术与酶传感器固定化酶：固定化酶： 保留或分布在一定的微环境下并具有催化活性的保留或分布在一定的微环境下并具有催化活性的生物催化剂。生物催化剂。酶的固定化：酶的固定化：通过某种方式将酶与载体结合，使酶被集中或限制，从通过某种方式将酶与载体结合，使酶被集中或限制，从而使固定化酶易于从底物或产物中分离出来。而使固定化酶易于从底物或产物中分离出来。优
47、点优点：增加酶活性和稳定性、重复利用降低酶耗、具有：增加酶活性和稳定性、重复利用降低酶耗、具有高转化数、保证产物的高纯度。高转化数、保证产物的高纯度。缺点缺点：对酶的物理化学性质产生影响，小心选择条件。：对酶的物理化学性质产生影响，小心选择条件。固定化酶常用的方式固定化酶常用的方式先将酶固定在固相载体上，然后将其装在一先将酶固定在固相载体上，然后将其装在一个小柱子中成为一个固定化酶反应柱。个小柱子中成为一个固定化酶反应柱。将酶固定化在电极上，以电化学的方式传导将酶固定化在电极上，以电化学的方式传导酶反应产物的信息。酶反应产物的信息。1.3.1 1.3.1 酶固定化方法酶固定化方法酶催化反应系统
48、的实用稳定性不仅与酶本身有关，酶催化反应系统的实用稳定性不仅与酶本身有关，而且与固相载体的稳定性相关而且与固相载体的稳定性相关通过共价结合的方式将酶固定在具有反应活性的不通过共价结合的方式将酶固定在具有反应活性的不溶性载体上或电极上溶性载体上或电极上一般来说，反应是通过酶分子上的亲核基团与活化一般来说，反应是通过酶分子上的亲核基团与活化载体上的功能基共价偶联实现的。反应时应选择酶载体上的功能基共价偶联实现的。反应时应选择酶分子上不参与催化反应的功能基团。分子上不参与催化反应的功能基团。酶分子中的氨基、羧基、及巯基参与共价偶联酶分子中的氨基、羧基、及巯基参与共价偶联1.3.1 1.3.1 酶固定
49、化方法酶固定化方法吸附、共价结合、静电结合、分子间交联、吸附、共价结合、静电结合、分子间交联、凝胶包埋和络合或金属结合凝胶包埋和络合或金属结合载体的分类：载体的分类：无机载体：高岭土、玻璃珠、氧化铝等无机载体：高岭土、玻璃珠、氧化铝等有机载体：纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺等有机载体：纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺等常用的固定相有：硅胶和可控硅玻璃型聚合常用的固定相有：硅胶和可控硅玻璃型聚合物物固定化方法与载体的选择固定化方法与载体的选择1.1.必须注意维持酶的催化活性和专一性必须注意维持酶的催化活性和专一性2.2.酶与载体结合牢固酶与载体结合牢固 3.3.载体的机械强度载体的机械强度4.4.固定化酶
50、要有最小的空间位阻固定化酶要有最小的空间位阻 5.5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应载体稳定，不可与底物、产物发生反应6.6.固定化酶要廉价固定化酶要廉价 现在基本已经实现商品化，厂商对于活化及现在基本已经实现商品化，厂商对于活化及固定化的条件已经优化好。固定化的条件已经优化好。具有反应活性的固相载体通常含有以下几种活性基团：氨具有反应活性的固相载体通常含有以下几种活性基团：氨基烷基、芳基氨基、羧基、巯基丙基及卤代烷等基烷基、芳基氨基、羧基、巯基丙基及卤代烷等常用的固定化技术常用的固定化技术：1.氨丙基官能团与硅类载体上的固定化；氨丙基官能团与硅类载体上的固定化；2.戊二醛偶联，用戊二醛活
51、化氨基修饰的固相表面戊二醛偶联，用戊二醛活化氨基修饰的固相表面3.酶在戊二醛修饰的载体上固定化酶在戊二醛修饰的载体上固定化4.碳二亚胺偶联碳二亚胺偶联5.由烷基氨基修饰的载体经与对硝基苯甲酰氯反应再还原制由烷基氨基修饰的载体经与对硝基苯甲酰氯反应再还原制备芳氨基载体备芳氨基载体6.芳氨基修饰载体经过重氮化反应与蛋白偶联芳氨基修饰载体经过重氮化反应与蛋白偶联含氨丙基功能基的可控硅是目前公认的最成含氨丙基功能基的可控硅是目前公认的最成功的经活化再结合酶的载体功的经活化再结合酶的载体固相功能基的活化采用最多的是固相功能基的活化采用最多的是戊二醛戊二醛，可，可以引入一个羰基，羰基然后与酶分子上的亲以引
52、入一个羰基，羰基然后与酶分子上的亲核基反应核基反应近来倾向于使用高聚物固相载体，这类载体近来倾向于使用高聚物固相载体，这类载体在碱性条件下稳定，且可以避免流动注射或在碱性条件下稳定，且可以避免流动注射或液相色谱系统中谱带加宽的现象液相色谱系统中谱带加宽的现象酶电极酶电极酶电极属于生物传感器，是一种检测器，它由固定酶电极属于生物传感器，是一种检测器，它由固定化酶和具有传感功能的电极紧密偶连在一起。化酶和具有传感功能的电极紧密偶连在一起。生物传感器：将一个生化的和一个屋里的转能器紧生物传感器：将一个生化的和一个屋里的转能器紧密的结合在一起，所产生的电信号与分析试剂浓度密的结合在一起，所产生的电信号
53、与分析试剂浓度之间有一个计量的关系之间有一个计量的关系适用于测定各种气体（如氧气、氢气及二氧化碳等）适用于测定各种气体（如氧气、氢气及二氧化碳等）、含氮化合物（如、含氮化合物（如NONO2 2，NHNH3 3）、离子活性（如碱金）、离子活性（如碱金属及重金属）及氧化还原型有机化合物，分析灵敏属及重金属）及氧化还原型有机化合物，分析灵敏度在度在亚微摩尔亚微摩尔数量级数量级酶电极测定法的发展历史酶电极测定法的发展历史2020世纪世纪6060年代初，年代初，ClarkClark引入酶电极这一新概引入酶电极这一新概念。念。19671967年，年，UpdikeheUpdikehe和和HicksHicks
54、将酶包埋在凝胶中，将酶包埋在凝胶中，使酶的使用稳定性有了进一步提高，并简化使酶的使用稳定性有了进一步提高，并简化了酶传感器制备的步骤了酶传感器制备的步骤19751975年，年，Yellow SpringsYellow Springs公司商品化了葡萄公司商品化了葡萄糖测定仪糖测定仪酶电极与固定化酶的比较1.电极上酶的固定化物理法：将酶直接吸附在电极的表面或阻截在非水溶性的高聚物凝胶中化学法：将酶通过偶联反应链接在转能器表面的活性剂团上，或者使用双功能基试剂对生物分子进行分子间交联2. 化学信号向电极的转移3. 3. 检测对象及分析特性检测对象及分析特性电化学酶传感器可以用于大约电化学酶传感器可以
55、用于大约140140多种化学物多种化学物质的检测，常见的有低分子量物质、大分子质的检测，常见的有低分子量物质、大分子化合物、病毒及微生物化合物、病毒及微生物电位电极和安培电极的检出限分别为电位电极和安培电极的检出限分别为210210-4-4和和110110-6-6mol/lmol/l，采用放大反映可以是检测限，采用放大反映可以是检测限低至低至nmol/lnmol/lpmol/lpmol/l。响应时间快，一个小时内可以进行几百个样响应时间快，一个小时内可以进行几百个样品的测定品的测定酶电极中的偶联酶反应酶电极中的偶联酶反应并不是所有酶催化反应所形成的产物都可以在点击并不是所有酶催化反应所形成的产
56、物都可以在点击上进行测定，有的需要采用偶联买反应以扩大可被上进行测定，有的需要采用偶联买反应以扩大可被检测化合物的范围检测化合物的范围利用偶联酶反应中的竞争原理可以实现用通常的酶利用偶联酶反应中的竞争原理可以实现用通常的酶电极无法检测的化合物（分析来自被分析对象和底电极无法检测的化合物（分析来自被分析对象和底物对同一种产生信号酶的竞争反应）物对同一种产生信号酶的竞争反应）将两种酶偶联组成一个循环系统可以使被分析信号将两种酶偶联组成一个循环系统可以使被分析信号放大，即大大提高分析灵敏度放大，即大大提高分析灵敏度通过另一个酶链反应可以提高酶电极的选择性，据通过另一个酶链反应可以提高酶电极的选择性，
57、据此可以消除由样品中杂质所引进的酶或电极带来的此可以消除由样品中杂质所引进的酶或电极带来的干扰干扰酶电极的应用酶电极的应用医学诊断：测定血清、医学诊断：测定血清、血浆、全血中的葡萄糖血浆、全血中的葡萄糖过程控制：糖类、抗坏过程控制：糖类、抗坏血酸、氨基酸及青霉素血酸、氨基酸及青霉素等的测定等的测定食品分析：气体电极食品分析：气体电极环境检测：毒性化合物、环境检测：毒性化合物、重金属离子、水、空气重金属离子、水、空气中有关成分的分析和监中有关成分的分析和监测测酶电极存在的问题酶电极存在的问题传感器必须经过消毒，这在目前来说是根本传感器必须经过消毒，这在目前来说是根本不可能的不可能的标准曲线应该用
58、分立的或原位的测定方法标准曲线应该用分立的或原位的测定方法被分析物的浓度经常超出传感器的线性范围被分析物的浓度经常超出传感器的线性范围要考虑各种存在的干扰物质要考虑各种存在的干扰物质热或机械张力会使传感器失活热或机械张力会使传感器失活1.3.3 1.3.3 流动系统中的固定化酶流动系统中的固定化酶在一个中等大小（在一个中等大小（5 5500ul500ul）的反应柱中，可固定）的反应柱中，可固定化的酶的量非常大（化的酶的量非常大（1000u1000u），远远大于酶电极（），远远大于酶电极（1 13u/cm3u/cm2 2）绝大多数情况下，酶催化反应的平衡十分有利于反绝大多数情况下，酶催化反应的平
59、衡十分有利于反应产物生成的方向，应产物生成的方向，100%100%的底物可以转化为可检测的底物可以转化为可检测的信号。的信号。对反应柱而言，由于酶量是大大过量的，因而离子对反应柱而言，由于酶量是大大过量的，因而离子强度、强度、pHpH、流速和温度的微笑变化或存在低浓度的、流速和温度的微笑变化或存在低浓度的抑制剂或激活剂都不会对酶反应柱的效率产生大的抑制剂或激活剂都不会对酶反应柱的效率产生大的影响。影响。1.3.4 1.3.4 固定化酶在分析流动系统中的固定化酶在分析流动系统中的 应用应用 1.活化剂和抑制剂的测定活化剂和抑制剂的测定2.（1）活化剂的测定）活化剂的测定活化剂的概念活化剂的概念：
60、是使酶成为活性催化剂所需要的一种化学：是使酶成为活性催化剂所需要的一种化学物质（如将非活性的酶朊转化为活性的全酶），或是一种物质（如将非活性的酶朊转化为活性的全酶），或是一种能提高活性酶催化效率的物质。能提高活性酶催化效率的物质。当活化剂浓度较小时，活化剂浓度与反应速度之间为正比当活化剂浓度较小时，活化剂浓度与反应速度之间为正比关系；当其浓度比较高时，由于酶的活性已经得到了最大关系；当其浓度比较高时，由于酶的活性已经得到了最大限度的活化，所以不再与活化剂浓度相关限度的活化，所以不再与活化剂浓度相关活化剂同非常并不具有特异性，因此，不同的物质可能活活化剂同非常并不具有特异性，因此，不同的物质可能
61、活化同一种酶。化同一种酶。活化剂的测定活化剂的测定MgMg2+2+和和MnMn2+2+活化异柠檬酸脱氢酶，根据这种活活化异柠檬酸脱氢酶，根据这种活化作用，低至化作用，低至5ng/ml5ng/ml的的MgMg2+2+可以被检测到。可以被检测到。全酶中的金属例子可以通过加入螯合剂除去，全酶中的金属例子可以通过加入螯合剂除去，由此产生的酶朊可用于该金属离子的测定。由此产生的酶朊可用于该金属离子的测定。例如，碱性磷酸酯酶的例如，碱性磷酸酯酶的ZnZn2+2+可以通过加入可以通过加入EDTAEDTA除去，所产生的酶朊可用于除去，所产生的酶朊可用于ZnZn2+2+的测定。的测定。（2 2）抑制剂的分析）抑
62、制剂的分析抑制剂的概念抑制剂的概念：是一类能引起酶活性下降：是一类能引起酶活性下降（但是并不引起蛋白变形），从而降低酶反（但是并不引起蛋白变形），从而降低酶反应速度的化学物质。应速度的化学物质。抑制剂可以与催化剂反应形成催化剂抑制剂可以与催化剂反应形成催化剂- -抑制剂抑制剂复合物，也可以与参与酶反应的一种试剂反复合物，也可以与参与酶反应的一种试剂反应。应。分为可逆型抑制与不可逆性抑制分为可逆型抑制与不可逆性抑制2 2 有机化合物的分析有机化合物的分析利用抑制酶反应可以测定一些具有抑制作用利用抑制酶反应可以测定一些具有抑制作用的有机化合物。的有机化合物。有机磷杀虫剂用于农业中控制有害昆虫对农有
63、机磷杀虫剂用于农业中控制有害昆虫对农作物的危害，其药效就是基于它们对于乙酰作物的危害，其药效就是基于它们对于乙酰胆碱的抑制作用，杀虫剂胆碱酯酶的活性的胆碱的抑制作用，杀虫剂胆碱酯酶的活性的影响可以用任何一种用于胆碱酯酶活性分析影响可以用任何一种用于胆碱酯酶活性分析方法来测定。方法来测定。3 3 无机化合物的分析无机化合物的分析一般来说，在对其他共存的金属离子不进行一般来说，在对其他共存的金属离子不进行预分离或岩壁的情况下，很难对另一种例子预分离或岩壁的情况下，很难对另一种例子进行选择性测定。进行选择性测定。掩蔽剂的选择依赖于多种因素，如共存金属掩蔽剂的选择依赖于多种因素，如共存金属离子，离子，
64、pHpH，底物及酶等。，底物及酶等。CNCN可以对可以对NiNi2+2+、CoCo2+2+、FeFe2+2+进行掩蔽进行掩蔽酶活性测定的应用酶活性测定的应用1.4.1 1.4.1 细胞内酶活性的测定细胞内酶活性的测定活性测定之前应注意的活性测定之前应注意的两个因素两个因素：在测定的早期对蛋白质水解酶的活性进行抑制，在测定的早期对蛋白质水解酶的活性进行抑制，否则会分解或破坏所要分析的酶活性否则会分解或破坏所要分析的酶活性避免小分子的干扰，它们会错误的被当成是酶的避免小分子的干扰，它们会错误的被当成是酶的底物或产物，还有可能是酶抑制剂。底物或产物，还有可能是酶抑制剂。单一类型细胞的制备单一类型细胞
65、的制备蔗糖密度梯度离心法：根据细胞密度不同蔗糖密度梯度离心法：根据细胞密度不同场流动分离法：根据细胞大小及形状不用场流动分离法：根据细胞大小及形状不用针对细胞表面标识物抗体：抗原针对细胞表面标识物抗体：抗原- -抗体，磁铁与抗体，磁铁与抗体偶联抗体偶联破坏法：对不感兴趣的细胞用选择性溶解方法去破坏法：对不感兴趣的细胞用选择性溶解方法去除除完整细胞表面酶活性的测定完整细胞表面酶活性的测定当反应液是由一种细胞组成时，对细胞表面当反应液是由一种细胞组成时，对细胞表面酶活性的测定要求测定过程中细胞完好无损。酶活性的测定要求测定过程中细胞完好无损。因为细胞内成分的存在会使测定结果失真。因为细胞内成分的存
66、在会使测定结果失真。例如，在测定细胞表面例如，在测定细胞表面ATP酶时，通常是检酶时，通常是检测反应产物测反应产物ADP，但若细胞部分溶解，则由，但若细胞部分溶解，则由于细胞内于细胞内ADP的干扰，所测定的的干扰，所测定的ATP酶活性酶活性就会出错。就会出错。亚细胞样品酶活性的测定亚细胞样品酶活性的测定超声波法：超声波法：French PressFrench Press：适用于具有刚性细胞壁的细：适用于具有刚性细胞壁的细菌的溶解菌的溶解匀浆法：用来破碎细胞膜比较容易破裂的细匀浆法：用来破碎细胞膜比较容易破裂的细胞的外层细胞膜，但大多数细胞器不受损伤胞的外层细胞膜，但大多数细胞器不受损伤1.4.
67、2 1.4.2 工业过程及产品中酶的测定工业过程及产品中酶的测定1.1.酶在去污剂、纺织、皮革及酒精工业方面酶在去污剂、纺织、皮革及酒精工业方面 的应用的应用将大分子降解为组成它们的基本单元，以加速这将大分子降解为组成它们的基本单元，以加速这些大分子化合物的去除些大分子化合物的去除只有水解酶在此领域有应用只有水解酶在此领域有应用（1 1）-及及-淀粉酶的测定淀粉酶的测定淀粉酶属水解酶类，能催化淀粉及糖原水解淀粉酶属水解酶类，能催化淀粉及糖原水解-淀粉酶淀粉酶又称淀粉内切酶，人体中的淀粉酶属又称淀粉内切酶，人体中的淀粉酶属于于-淀粉酶，使含连续三个或以上的葡萄糖单淀粉酶，使含连续三个或以上的葡萄
68、糖单体的分子的体的分子的1,4- -1,4- -糖苷键水解糖苷键水解-淀粉酶淀粉酶又称外切酶，主要将又称外切酶，主要将-麦芽糖从淀粉麦芽糖从淀粉或其他化合物上释放出来。或其他化合物上释放出来。测定淀粉酶的最简单方法是测定将淀粉测定淀粉酶的最简单方法是测定将淀粉- -碘的颜碘的颜色由蓝色转化为红棕色所需的时间色由蓝色转化为红棕色所需的时间工业产品中淀粉酶的测定工业产品中淀粉酶的测定p p p p- - - -硝基苯硝基苯硝基苯硝基苯-D-D-D-D-麦芽糖苷麦芽糖苷麦芽糖苷麦芽糖苷 p p p p- - - -硝基苯麦芽三糖硝基苯麦芽三糖硝基苯麦芽三糖硝基苯麦芽三糖+ + + +麦芽四糖麦芽四糖
69、麦芽四糖麦芽四糖p p p p- - - -硝基苯麦芽三糖硝基苯麦芽三糖硝基苯麦芽三糖硝基苯麦芽三糖 p p p p- - - -硝基苯葡萄糖苷硝基苯葡萄糖苷硝基苯葡萄糖苷硝基苯葡萄糖苷+2+2+2+2葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖p p p p- - - -硝基苯葡萄糖苷硝基苯葡萄糖苷硝基苯葡萄糖苷硝基苯葡萄糖苷 p p p p- - - -硝基苯酚硝基苯酚硝基苯酚硝基苯酚+ + + +葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖405nm405nm处吸光度（处吸光度（p p- -硝基苯酚）的增加正比于淀粉酶的活性。硝基苯酚）的增加正比于淀粉酶的活性。文献中对多种不同的分析步骤所采用淀粉酶活性的单位不同文献中对多种不
70、同的分析步骤所采用淀粉酶活性的单位不同淀粉酶淀粉酶淀粉糖苷酶淀粉糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶（2 2）淀粉糖苷酶的测定）淀粉糖苷酶的测定淀粉糖苷酶从淀粉和其他分子上除去连续的葡萄糖分子淀粉糖苷酶从淀粉和其他分子上除去连续的葡萄糖分子最佳方法是测定葡萄糖生成的速度最佳方法是测定葡萄糖生成的速度酶分析法：酶分析法：葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ATP +ATP +ATP +ATP 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖-6-6-6-6-磷酸磷酸磷酸磷酸+ADP+ADP+ADP+ADP葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖-6-6-6-6-磷酸磷酸磷酸磷酸+NAD+NAD+NAD+NAD+ + + + 6- 6- 6- 6-磷酸葡萄
71、糖酸磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸+NADH+H+NADH+H+NADH+H+NADH+H+ + + +在在340nm340nm处测定反应生成物处测定反应生成物NADHNADH的吸光度，其值的大小正的吸光度，其值的大小正比于葡萄糖浓度比于葡萄糖浓度1 1个淀粉糖苷酶活性单位定义为在、温度个淀粉糖苷酶活性单位定义为在、温度55 55 的条件下的条件下1min1min内从淀粉上水解下内从淀粉上水解下1mg1mg葡萄糖所需酶的量葡萄糖所需酶的量己糖激酶己糖激酶葡萄糖葡萄糖-6-P脱氢酶脱氢酶（3 3）纤维素酶的测定）纤维素酶的测定纤维素酶催化水解纤维素、地衣淀粉及其他多糖纤维素酶催化水解纤维素
72、、地衣淀粉及其他多糖中的中的1,4-1,4-糖苷键。糖苷键。1 1个活性单位的该酶在、个活性单位的该酶在、3737下下1h1h内可以从纤维内可以从纤维素上水解素上水解1umol1umol的葡萄糖的葡萄糖葡萄糖测定的方法也适用与纤维素酶的测定葡萄糖测定的方法也适用与纤维素酶的测定（4 4）脂肪酶的测定）脂肪酶的测定脂肪酶可以催化使脂肪酸从甘油三酯分子中释放脂肪酶可以催化使脂肪酸从甘油三酯分子中释放出来出来脂肪酸形成的速度可以用标准碱溶液滴定，也可脂肪酸形成的速度可以用标准碱溶液滴定，也可以用微量量热法以用微量量热法1 1个活性单位的该酶在、个活性单位的该酶在、 37 371h1h从甘油三酯中释从
73、甘油三酯中释放处放处1 1微当量的脂肪酸微当量的脂肪酸（5 5）临床诊断中酶的测定）临床诊断中酶的测定酶缺陷引起的疾病多为遗传病，酶活性异常往往酶缺陷引起的疾病多为遗传病，酶活性异常往往可以用来诊断疾病可以用来诊断疾病血清及尿中的淀粉酶主要用于胰腺炎的诊断血清及尿中的淀粉酶主要用于胰腺炎的诊断天门冬氨酸转移酶增高天门冬氨酸转移酶增高4 41010倍，可帮助确诊心倍，可帮助确诊心肌梗塞症肌梗塞症1.4.3 1.4.3 酶在生化分析中应用的发展趋酶在生化分析中应用的发展趋势势单细胞分析单细胞分析分离和测定同时进行，最终在单细胞和亚细胞水分离和测定同时进行，最终在单细胞和亚细胞水平上进行生命的分子过
74、程研究平上进行生命的分子过程研究毛细管电泳和毛细管电色谱能够很好的适用于单毛细管电泳和毛细管电色谱能够很好的适用于单细胞分析。细胞分析。酶作为标记物的分析作用酶作为标记物的分析作用广泛用于免疫分析、核酸分子杂交等领域广泛用于免疫分析、核酸分子杂交等领域模拟酶（人工酶）分析模拟酶（人工酶）分析两种途径：对酶的活性中心功能团的模拟；对酶两种途径：对酶的活性中心功能团的模拟；对酶的作用方式模拟的作用方式模拟通过合成各种具有不同取代基的金属卟啉衍生物通过合成各种具有不同取代基的金属卟啉衍生物和使中心金属离子具有不同的轴向配体，已经初和使中心金属离子具有不同的轴向配体，已经初步实现了对过氧化物酶、过氧化氢酶的模拟步实现了对过氧化物酶、过氧化氢酶的模拟以酶催化反应过渡态的类似物作为半抗原以酶催化反应过渡态的类似物作为半抗原催催化抗体化抗体
