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1、 第十八章第十八章 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗 (gene diagnosis and therapy)(gene diagnosis and therapy) 1本章主要内容 基因诊断基因诊断 基因治疗基因治疗2 一一. . 基因诊断概念基因诊断概念 利用分子生物学方法，利用分子生物学方法，直接检测基因结直接检测基因结构及其表达水平是否异常构及其表达水平是否异常，从而对疾病作出，从而对疾病作出诊断诊断, ,为治疗提供依据。为治疗提供依据。第一节第一节 基基 因因 诊诊 断断3二二. . 基因诊断基因诊断特点特点： 针对性强，特异性高针对性强，特异性高 检测灵敏度和精确性高检测灵敏度
2、和精确性高 实用性强，诊断范围广实用性强，诊断范围广 4三三. . 基因诊断常用技术方法基因诊断常用技术方法 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）技术）技术 生物芯片生物芯片 基因测序基因测序5（一）核酸分子杂交技术（一）核酸分子杂交技术 核酸分子杂交核酸分子杂交 是指一条单链核酸分子（是指一条单链核酸分子（DNADNA或或RNARNA）通过碱基互补与另一条）通过碱基互补与另一条单链核酸分子形成稳定双链的过程。单链核酸分子形成稳定双链的过程。 基本原理：基本原理： 碱基互补、变性和复性碱基互补、变性和复性 DNADNA与与DNADNA杂交：杂交： A=T
3、A=T、 GC ;GC ; DNADNA与与RNARNA杂交杂交: : A=UA=U、 GC ;GC ; 变性：变性： 升高温度至升高温度至9494左右左右，使核酸双链解开为两条单链；，使核酸双链解开为两条单链； 复性：复性： 缓慢降低温度（缓慢降低温度（ 5252左右左右），变性的两条单链重新形成互），变性的两条单链重新形成互 补双链。补双链。 碱基互补碱基互补6 hybridizationDNA:DNA 5 A T G C C G A T 3 T A C G G C DNA:RNA 5 A T G C G T A 3 U A C G C A U RNA:RNA 5 A U G C U A
4、C G 3 U A C G A U G C7 利用核酸双链的利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的碱基互补、变性和复性的原理，可以原理，可以用已用已知碱基序列的单链核酸片段知碱基序列的单链核酸片段作为作为探针探针，与待测样本中的单链核，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。 核酸探针核酸探针 是指带有标记的、并已知碱基序列的是指带有标记的、并已知碱基序列的DNADNA或或RNARNA片段，能与片段，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。 探针标记
5、物探针标记物 有有放射性核素放射性核素或或非放射性核素非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）（生物素、地高辛、荧光素等）两大类。两大类。8 1.1.核酸分子杂交的分类核酸分子杂交的分类 液相杂交液相杂交 待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应；进行杂交反应； 固相杂交固相杂交 待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应液中的特异性探针进行杂交反应。 常用固相杂交支持物：常用固相杂交支持物： 硝酸纤维素膜、尼龙膜等硝酸纤维素膜、尼龙膜等 92.2.核酸分子杂交（固相杂交）操作
6、程序核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化分离、变性、转移、固化DNADNA片段片段杂交杂交加入标记核酸探针加入标记核酸探针检测杂交信号检测杂交信号标记核酸探针标记核酸探针预预杂交杂交制备核酸探针制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针漂洗去除未参与杂交的标记探针10 3. 3. 常用固相核酸杂交方法常用固相核酸杂交方法 Southern Southern 印迹杂交法印迹杂交法（Southern blotting Southern blotting ） Northern Northern 印迹杂交法印迹杂交法（Northern blotting
7、Northern blotting ） 斑点杂交或狭缝杂交法斑点杂交或狭缝杂交法（Spot/ Slot blot hybridizationSpot/ Slot blot hybridization） 菌落杂交菌落杂交（colony hybridizationcolony hybridization） 夹心杂交法夹心杂交法（sandwich hybridizationsandwich hybridization） 原位杂交原位杂交（ hybridization in situhybridization in situ）11 (1) Southern 印迹杂交法印迹杂交法 限制性内切酶酶切 检测
8、杂交信号检测杂交信号 提取提取DNADNA Southern Southern 法可用于法可用于检测特异的检测特异的DNADNA序列片段序列片段, ,进进行基因定位、分子量测定等。行基因定位、分子量测定等。12（2 2）Northern Northern 印迹杂交法印迹杂交法 （其基本过程类似于上述（其基本过程类似于上述SouthernSouthern法）法） 提取提取RNARNA样本样本RNARNA变性变性琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离转移至膜转移至膜探针（标记探针（标记DNADNA或或RNARNA）与之杂交）与之杂交显影显影或显色或显色检测信号。检测信号。 NorthernNorth
9、ern法可用于检测组织细胞中总法可用于检测组织细胞中总RNARNA或或mRNAmRNA 13（3 3）斑点杂交或狭缝杂交法）斑点杂交或狭缝杂交法 基本过程：基本过程： 将变性的将变性的DNADNA或或RNARNA直接点到固相支持滤膜上直接点到固相支持滤膜上用标记用标记探针与之杂交探针与之杂交自显影或显色反应自显影或显色反应检测杂交信号检测杂交信号分析结分析结果果。 优点：优点： 简便、快速、灵敏、样本用量少；简便、快速、灵敏、样本用量少； 缺点：缺点： 特异性不高，有一定比例的假阳性。特异性不高，有一定比例的假阳性。 用途：用途： 检测样本中存在的微量检测样本中存在的微量DNADNA或或RNA
10、 RNA 14（4 4）菌落杂交）菌落杂交 该法可从大量细菌中筛选含特异的该法可从大量细菌中筛选含特异的DNADNA序列及基因工程重组体。序列及基因工程重组体。15（5 5）夹心杂交法）夹心杂交法 ABREREREREABAB固固相相支支持持物物片段片段B B捕捉探针捕捉探针 片断片断A A 检测探针检测探针 本法优点：本法优点： 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。16（6 6）原位杂交）原位杂交 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而 检测特异的检测特异的DNADNA或或RNARNA序
11、列。序列。 细胞原位杂交细胞原位杂交 组织切片原位杂交组织切片原位杂交 DNA-DNADNA-DNA RNA-DNA RNA-DNA 三类杂交三类杂交 RNA-RNARNA-RNA 该法优点：该法优点： 不需提取核酸，不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。更能准确地反映组织细胞的功能状态。有有17（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应（PCRPCR）技术）技术 PCRPCR是利用体内是利用体内DNADNA复制的原理和复制的原理和DNADNA变性与复性的性质，变性与复性的性质，在体外对目的基因在体外对目的基因DNADNA
12、进行进行大量扩增的技术。大量扩增的技术。 1.1. PCRPCR基本原理：基本原理： PCRPCR技术在模板技术在模板DNADNA、dNTPdNTP、MgMg2+2+、合适、合适BufBuf. .等条件下，用等条件下，用耐热的耐热的TaqTaq聚合酶聚合酶代替代替DNADNA聚合酶聚合酶，用合成的，用合成的DNADNA引物引物代替代替RNARNA引引物物，经过，经过DNADNA变性变性、引物与模板结合（、引物与模板结合（复性复性）和）和延伸延伸3 3个步骤的个步骤的反复循环反复循环 （2525 3030次）过程，使目的次）过程，使目的DNADNA呈指数呈指数扩增扩增 。18 PCRPCR技术原
13、理示意图技术原理示意图（ 9494左右左右）（5252左右）左右）（7272左右）左右）19（1 1）DNADNA模板的模板的热变性热变性 将待扩增将待扩增DNADNA加热到加热到94940 0C C左右，使双链左右，使双链DNADNA解开成解开成为单链，并游离于反应体系中作为模板。为单链，并游离于反应体系中作为模板。（2 2）模板与引物的结合（）模板与引物的结合（退火或复性退火或复性） 将将体体系系温温度度降降至至合合适适温温度度（52520 0C C左左右右），使使加加入入的引物与模板的引物与模板DNADNA两端（两端（33端）碱基序列互补结合。端）碱基序列互补结合。20（3 3）引物）引
14、物延伸延伸 将体系温度升到将体系温度升到72720 0C C左右，左右，TaqTaq聚合酶催化聚合酶催化dNTPdNTP 按碱基互补原则连接在按碱基互补原则连接在DNADNA引物引物33端，使链延伸，端，使链延伸， 形成两条与模板互补的新链。形成两条与模板互补的新链。 以上为以上为1 1次次PCRPCR循环循环（变性、复性和延伸）（变性、复性和延伸） （新合成的链可作为下一轮循环的模板新合成的链可作为下一轮循环的模板） 按照上述按照上述（变性、复性和延伸）（变性、复性和延伸）3 3个个步骤反复循环步骤反复循环 ，PCRPCR产物呈指数扩增。产物呈指数扩增。 模板模板DNA DNA 扩增倍数扩增
15、倍数T=2T=2n n (n: (n: 循环次数循环次数) )。21 2. PCR2. PCR各要素及其作用各要素及其作用（1 1） 模板模板 PCRPCR模板可以是模板可以是DNADNA或或RNARNA。 以线性以线性DNADNA模板为佳，量适中，一般为模板为佳，量适中，一般为10102 2 10105 5个拷贝；个拷贝； RNARNA作为模板时，作为模板时，需要：需要： RNA RNA cDNAcDNA PCR, PCR, 称此为称此为RT-PCR.RT-PCR. （2 2）耐热）耐热DNADNA聚合酶聚合酶( (TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶) ) 是是从从耐耐热热细细菌菌体体
16、内内提提取取的的一一种种DNADNA聚聚合合酶酶，可可在在9595稳稳定定3030分分钟钟。从从而而保保证证PCRPCR在在 9494变变性性 5252退退火火7272延延伸伸 循环循环3030次过程中不变性失活。次过程中不变性失活。 逆转录逆转录22（3 3）引物）引物 引物是根据已知序列的模板引物是根据已知序列的模板DNADNA待扩增区两端而设计的待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为一对寡核苷酸小片断，长度一般为1515 3030个碱基。个碱基。 引物是引物是保证保证PCRPCR扩增产物的大小和特异性的关键因素，其扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对设计与合成对P
17、CRPCR的成功至关重要。的成功至关重要。 引物设计原则如下：引物设计原则如下：23 引物设计应符合以下基本原则：引物设计应符合以下基本原则： 长度适宜，一般为长度适宜，一般为1515 3030个碱基；个碱基； G+CG+C含量，一般为含量，一般为4040 6060； 4 4种碱基应随机性分布；种碱基应随机性分布； 引物自身不应存在互补序列；引物自身不应存在互补序列； 两个引物之间不应有多于两个引物之间不应有多于4 4个碱基的互补；个碱基的互补； 引物引物33端不应有任何修饰；端不应有任何修饰； 引物引物55可以修饰。可以修饰。24（4 4）缓冲溶液与）缓冲溶液与MgMg2+2+ PCRPCR
18、技技术术常常用用1010 50mmol/L 50mmol/L Tris-HClTris-HCl、Ph8.3Ph8.3 8.888.88、偏碱缓冲液；并含有一定量的偏碱缓冲液；并含有一定量的MgMg2+2+浓度；浓度；（5 5）dNTPdNTP浓度浓度 PCRPCR一一般般用用5050 200200mol/Lmol/L的的dNTPdNTP；并并且且4 4种种dNTPdNTP浓浓度应相等；度应相等；25（6 6）参数）参数 变性温度与时间变性温度与时间 一般选择：一般选择： 94940 0C C， 3030秒秒 退火温度与时间退火温度与时间 取决于引物长度、浓度取决于引物长度、浓度 和和G+CG+
19、C含量，含量， 一般选择：一般选择： Tm - 5Tm - 5 延伸温度与时间延伸温度与时间 一般选择：一般选择： 7070 7575循环次数循环次数 取决于模板浓度，取决于模板浓度， 一般循环：一般循环：3030次次26 PCRPCR操作操作 各种各种PCRPCR反应的操作基本相同，只是根据引物与靶序列不同，反应的操作基本相同，只是根据引物与靶序列不同，选择不同的反应体系和循环参数。选择不同的反应体系和循环参数。 将将PCRPCR反应管置于反应管置于DNADNA自动化热循环仪上，输入各种循环参数，自动化热循环仪上，输入各种循环参数，使使DNADNA扩增在热循环仪上很方便地完成。扩增在热循环仪
20、上很方便地完成。 PCRPCR技术优点技术优点 特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快速、特异地扩增任何不高，能快速、特异地扩增任何DNADNA片断。片断。 PCRPCR缺点缺点 由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。 27 3. PCR3. PCR产物分析产物分析（1 1）凝胶电泳分析法）凝胶电泳分析法 可可用用琼琼脂脂糖糖（AgroseAgrose）或或聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺（PAGEPAGE）凝胶电泳检测凝胶电泳检测PCRPCR扩增产物的大小。扩增产物的大小。 同同时时应应
21、以以标标准准DNADNA分分子子量量作作平平行行对对照照，凝凝胶胶中中加加入入溴溴化化乙乙锭锭，电电泳泳后后，紫紫外外检检测测仪仪下下观观察察结结果果并并拍拍照。照。 （在在待待检检靶靶序序列列拷拷贝贝数数多多、且且仅仅扩扩增增出出一一条条带带时时，用用此此法法即可满足检测要求。）即可满足检测要求。）28（2 2）点杂交分析法）点杂交分析法 该法有该法有2 2种：种： 将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备一张膜，将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备一张膜，然后用不同的特异探针进行杂交；然后用不同的特异探针进行杂交； 将不同的探针固定在膜上，再用有标记的将不同的探针固定在膜上，再用有标记
22、的PCRPCR产物产物 与之与之杂交。杂交。 本法有助于检测突变本法有助于检测突变DNADNA类型，用于人类遗传病诊断和某类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分析。些基因的分析。 ( (当扩增产物时多条带时，用此法更合适。当扩增产物时多条带时，用此法更合适。) )29 ( (三三) )基因芯片基因芯片 将大量序列已知的基因片段以微阵列方式固定在一芯片上将大量序列已知的基因片段以微阵列方式固定在一芯片上做成高密度的点阵排列，与标记样品进行杂交，然后用计算机做成高密度的点阵排列，与标记样品进行杂交，然后用计算机分析杂交信号。分析杂交信号。30 ( (四四) ) 基因测序基因测序 即，即，DNADN
23、A碱基序列分析，这是最确切、最直接碱基序列分析，这是最确切、最直接的基因诊断方法。的基因诊断方法。 目前常用的方法为目前常用的方法为MaxamMaxam-Gilbert-Gilbert建立的建立的化学化学裂解法裂解法和和SangerSanger建立的建立的双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法。 31 四四. . 基因诊断的临床应用基因诊断的临床应用( (一一) ) 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断( (二二) ) 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断( (三三) ) 感染性疾病的基因诊断感染性疾病的基因诊断32 举例：举例： 镰刀状红细胞贫血镰刀状红细胞贫血 珠蛋白基因的第六个密码子珠蛋白基因的第六个密码
24、子A ATT 表达产物：表达产物：谷谷氨酸氨酸缬缬氨酸氨酸 一个碱基突变一个碱基突变缺失缺失1 1个个MstMst内切酶内切酶位点位点 正常人正常人： 1.1kb1.1kb 患者：患者： 1.3kb1.3kb33 53 53 1.1 kb 1.3kb M Mstst IIII酶切位点酶切位点（CCTNATGCCTNATG）正常基因正常基因突变基因突变基因1.3kb1.1kb0.2kb123 1 1、正常人、正常人 2 2、突变携带者、突变携带者 3 3、患者、患者34 第二节第二节 基因治疗基因治疗 基因治疗的概念基因治疗的概念 基因治疗的总体策略基因治疗的总体策略 基因治疗的基本程序基因治疗
25、的基本程序 基因治疗的现状与展望基因治疗的现状与展望35一、基因治疗概念一、基因治疗概念 狭义概念狭义概念 用具有正常功能的基因去用具有正常功能的基因去置换或增补置换或增补患者体内有缺陷的患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。基因，从而达到治疗疾病的目的。 广义概念广义概念 将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。用，最终达到治疗疾病的目的。 36二、基因治疗的总体策略二、基因治疗的总体策略 基因矫正基因矫正 基因置换基因置换 基因增补基因增补 基因失活基因失活 “自杀基因自杀基因”的应用的应用 免疫基
26、因治疗免疫基因治疗 耐药基因治疗耐药基因治疗 37（一）基因矫正（一）基因矫正（gene correction） 对于致病基因中的对于致病基因中的异常碱基异常碱基进行进行精确修复精确修复，使其恢复，使其恢复正常功能正常功能。 （二）基因置换（二）基因置换(gene replacement) 用正常基因在原位用正常基因在原位替换替换致病基因，使细胞致病基因，使细胞DNADNA完全恢复完全恢复正常状态。正常状态。 38（三）基因增补（三）基因增补* *(gene augmentation) 将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补
27、偿缺陷基因的功能起表达，以补偿缺陷基因的功能 （但致病基因未去除）。（但致病基因未去除）。（四）基因失活（四）基因失活(gene inactivation) 指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互补作用与指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互补作用与mRNAmRNA结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常表达，以抗肿瘤、结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常表达，以抗肿瘤、抗病毒。抗病毒。 反义反义RNA:RNA: 干扰干扰mRNAmRNA的互补的互补RNA;RNA; 反义反义DNA:DNA: 干扰干扰DNADNA的互补的互补DNA.DNA.39（五）（五）“自杀基因自杀基因”的应用的应用 自杀基因自杀基因(s
28、uicide gene) 这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞自身杀死，这种毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞自身杀死，这种基因被称为基因被称为“自杀基因自杀基因”。 如果将如果将自杀基因自杀基因导入肿瘤细胞，则可将肿瘤细胞杀死。导入肿瘤细胞，则可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。但对正常细胞则无伤害作用。 40（六）免疫基因治疗（六）免疫基因治疗 将某些细胞因子（将某些细胞因子（IL-2IL-2、GM-CSFGM-CSF等）基因导入等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵
29、抗力。肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。 （七）耐药基因治疗（七）耐药基因治疗 在肿瘤化疗过程中，在肿瘤化疗过程中， 把产生抗药物毒性的基把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。疗。41 三、三、 基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序（一）治疗性基因的获得（一）治疗性基因的获得 在了解疾病发生的分子机制基础上，在了解疾病发生的分子机制基础上， 选择对疾病有治选择对疾病有治疗作用的特定基因。疗作用的特定基因。 如，对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因如，对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；即可用
30、于治疗； 对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。或抑癌基因用于基因治疗。 治疗性基因获得的方法很多：治疗性基因获得的方法很多： 用用酶切或探针杂交法酶切或探针杂交法从基因组从基因组DNADNA文库获得，从文库获得，从cDNAcDNA文库文库获取，获取，PCRPCR扩增，人工合成等。扩增，人工合成等。42（二）基因载体的选择（二）基因载体的选择 基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。入患者体内、并能调控其适度表达。 常用的载体有两类：常用
31、的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体和非病毒载体。 病毒载体病毒载体：逆转录病毒载体，逆转录病毒载体， 腺病毒载体，腺病毒载体， 腺相关病毒载体等；腺相关病毒载体等； 非病毒载体非病毒载体： 与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。因转移入患者体内。43（三）靶细胞的选择（三）靶细胞的选择 基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两大类。大类。 对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发育对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因，理论上讲是根治
32、遗成长的个体及其后代均具有正常基因，理论上讲是根治遗传病的理想方法。传病的理想方法。 但由于涉及安全性和伦理学问题，但由于涉及安全性和伦理学问题，目前基因目前基因治疗中禁止使用治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用体细胞。体细胞。 44 人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两人类基因治疗中，将治疗基因导入靶细胞有两种种途径。途径。 一种一种为为直接体内疗法（直接体内疗法（in vivoin vivo）：）： 即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞；即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞； 另一种另一种为为间接体内疗法（间接体内疗法（ex vivoex vi
33、vo）： 即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病人体内，达到治疗目的。人体内，达到治疗目的。45 治疗基因治疗基因导入受体细导入受体细胞的方法胞的方法 化学方法化学方法物理方法物理方法膜融合法膜融合法病毒载体法病毒载体法质粒质粒DNADNA直接转移法直接转移法（四）基因转移方法（四）基因转移方法 磷酸钙法磷酸钙法 DEAEDEAE葡聚糖法葡聚糖法 电穿孔法电穿孔法 粒子轰击法（基因枪法）粒子轰击法（基因枪法）46 ( ( 五五 ) ) 转导细胞的选择鉴定转导细胞
34、的选择鉴定 标记基因技术标记基因技术 基因缺陷型受体细胞技术基因缺陷型受体细胞技术 基因共转染技术基因共转染技术 分子杂交技术分子杂交技术 外源基因表达鉴定外源基因表达鉴定 ( ( 六六 ) ) 回输体内回输体内 将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输体内。将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输体内。47 四、基因治疗的应用与展望四、基因治疗的应用与展望 ( (一一) )基因治疗应满足的条件：基因治疗应满足的条件： 1 1、单基因缺陷疾病、单基因缺陷疾病 2 2、仅限体细胞的基因治疗、仅限体细胞的基因治疗 3 3、靶细胞易获取、培养、及回输体内。、靶细胞易获取、培养、及回输体内。 4 4、治疗效果
35、应胜过对病人的危害。、治疗效果应胜过对病人的危害。 5 5、表达水平无需调控且无副作用。、表达水平无需调控且无副作用。 6 6、需经动物实验验证安全可行、需经动物实验验证安全可行。 48 （二）基因治疗有待解决的问题（二）基因治疗有待解决的问题 1 1、难以获得真正有治疗作用的基因。、难以获得真正有治疗作用的基因。 2 2、外源基因的表达难以在体内精确调控。、外源基因的表达难以在体内精确调控。 3 3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有 改变。改变。 4 4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。 5 5、随机整合潜在
36、的威胁。、随机整合潜在的威胁。 49 基因诊断与基因治疗（课堂练习）基因诊断与基因治疗（课堂练习）1. 1. 核酸分子杂交主要内容有核酸分子杂交主要内容有A.A. 制备核酸样本制备核酸样本 B. B. 制备与标记特异探针制备与标记特异探针B.B.C. C. 核酸样本的分离、变性、转移和固定核酸样本的分离、变性、转移和固定D.D. 预杂交、杂交和漂洗预杂交、杂交和漂洗 E. E. 检测杂交信号检测杂交信号2.2.下列是常用核酸杂交方法的用途，错误的是下列是常用核酸杂交方法的用途，错误的是A.A.Southern Southern 印迹杂交法可用于检测特异印迹杂交法可用于检测特异RNARNA序列片
37、断序列片断 B.B.Southern Southern 印迹杂交法可用于检测特异印迹杂交法可用于检测特异DNADNA序列片断序列片断C.C.NorthernNorthern印迹杂交法可用于检测印迹杂交法可用于检测DNADNA或或RNARNAD.D.NorthernNorthern印迹杂交法可用于检测印迹杂交法可用于检测RNARNAE.E.原位杂交法可用于检测组织细胞中的原位杂交法可用于检测组织细胞中的DNADNA或或RNARNA503. 3. 以下是关于以下是关于PCRPCR技术的叙述，错误是技术的叙述，错误是A.A. PCRPCR技术进行体外技术进行体外DNADNA扩增，其过程不同于体内扩增
38、，其过程不同于体内DNADNA复制过程复制过程B.B. 需要目的需要目的DNADNA两条链为模板两条链为模板C.C. 需需TaqTaq 酶代替酶代替DNADNA聚合酶聚合酶D.D. 需需RNARNA引物代替引物代替DNADNA引物引物E.E. PCRPCR经过经过DNADNA变性、复性和延伸变性、复性和延伸3 3个步骤的反复循环个步骤的反复循环4.4. 基因诊断常用技术有基因诊断常用技术有A.A. 核酸分子杂交核酸分子杂交 B. B. 聚合酶链反应聚合酶链反应C.C. 基因芯片基因芯片 D. D. 基因测序基因测序D.D.E. E. 以上都可以以上都可以51 52Eggs are coaxed
39、 to mature in a culture dish. Each has a remnant egg cell called the polar body and cumulus cells from the ovary clinging to it. 53 While an egg is held still with a pipette, a needle is used to drill through the zona pellucida, removing a plug. 54 After ejecting the zona plug, the needle is inserte
40、d back in the egg through the hole to withdraw and discard the polar body and the eggs genetic material. 55 A cumulus cell from another egg is taken up into the needle. Cells called fibroblasts (or their nuclei) can also be used in this step. 56 The cumulus cell is injected deep into the egg that ha
41、s been stripped of its genetic material. 57 The injected egg is exposed to a mixture of chemicals and growth factors designed to activate it to divide. 58 After roughly 24 hours, the activated egg begins dividing. The cells contain genetic material only from the injected cumulus cell. 59 By the four
42、th or fifth day, a hollow ball of roughly 100 cells has formed. It holds a clump of cells called the inner cell mass that contains stem cells. 60 The blastocyst is broken open, and the inner cell mass is grown in a culture dish to yield stem cells. 61 The stem cells, in turn, can be coaxed to grow into a variety of cells that might one day be injected into patients. -62
