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1、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活力的测定方法: 改良赖氏法改良赖氏法 组员：组员： 魏青宇魏青宇 何彩云何彩云 肖磊肖磊 柯艾青柯艾青【目的要求】1.了解血清ALT活力单位的定义。2.掌握血清ALT活性测定的方法及临床意义。 血清酶活力测定的临床意义原理：正常情况下，血清中各种酶含量稳定，病理情况下则反之。如：许多组织器官的疾病表现为血清酶活力的异常。通过血清酶活力的测定可以作为器官，组织疾病及恶性肿瘤的临床诊断。造成血清酶活力异常的原因有：（1）细胞酶及细胞标志酶的释放入血液 （2）酶的合成增强 （3）酶清除受阻（4）器官功能损伤 详见p54实例说明实例说明： ALT测定的临床意义ALT广泛
2、存在于机体的各种组织中，但在肝细胞中含量最多。当肝脏有病变时特别是急性肝炎及肝细胞坏死时，血清中ALT活力显著升高。在肝癌，肝硬变及胆道疾病时，此酶活力也可中度或轻度增高。另外，其他脏器或组织疾病，该酶活力也升高。how?知识回顾知识回顾:血清中碱性磷酸酶（ALP)活力的测定（磷酸苯二钠法） ALP磷酸苯二钠+H2O苯酚+磷酸氢二钠pH=10 酶促反应苯酚+4-氨基安替比林铁氰化钾红色醌亚胺衍生物 显色反应碱性磷酸酶活力的测定的方法（碱性磷酸酶活力的测定的方法（标准对照法标准对照法） 项项 目目 T S B C血清/mL0.100_酚标准工作液/mL_0.100_蒸馏水/mL_0.100_pH
3、=10的碳酸盐缓冲液/mL1.001.001.001.00混匀。37C水浴保温5min,同时将底物液预热。底物液/mL1.001.001.001.00混匀。37C水浴保温15min铁氰化钾溶液/mL3.003.003.003.00血清/mL_0.100(2)本次实验的方法：本次实验的方法：改良赖氏法卡门氏法酶活力单位：1ml血清（反应总量为3ml）在25，340nm，内径为1cm的比色皿，1分钟，A下降0.001的酶量赖氏法： ALT丙氨酸+ -酮戊二酸 谷氨酸+丙酮酸丙酮酸+2,4二硝基苯肼 OH - 丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，改良赖氏法改良赖氏法本实验卡门氏法测ALT活力的方法为什么被赖
4、氏法取代？他们各自的测定原理，说明两种方法的区别与联系？答：答：由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此ALT的活性可通过NADH（反应物）（反应物）的减少的减少量，亦即通过340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测酶ALT的底物外，还需要加入指示指示酶酶LDH及其辅酶及其辅酶NADH，又需用紫外分光光度计紫外分光光度计，因此不易为一般临床化验室推广。答：答：丙氨酸+ -酮戊二酸 ALT 谷氨酸+丙酮酸 丙酮酸+NADH 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 乳酸+NAD+卡氏测定卡氏测定ALT活力的原理活力的原理小结小结：区别与联系区别与联系卡门氏法卡门
5、氏法赖氏法赖氏法（比色法）区别区别（1）动力学法（又称连续监测法或速率法）（2）偶联酶反应法（1）终止测定法联系联系通过测底物或产物 的变化测酶的活力 实验原理：实验原理：知识链接：转氨基作用是一种是一种-氨基酸的氨基酸的-氨基转移到一种氨基转移到一种-酮酸上的过程。转氨酮酸上的过程。转氨基作用是氨基酸基作用是氨基酸脱氨基脱氨基作用的一种途径。其实可以看成是氨作用的一种途径。其实可以看成是氨基酸的氨基与基酸的氨基与-酮酸的酮基进行了交换酮酸的酮基进行了交换。作用作用：结果是生成了一种非必需氨基酸和一种新的：结果是生成了一种非必需氨基酸和一种新的-酮酸。酮酸。 碱性条件下，产物由黄色变为红棕色碱
6、性条件下，产物由黄色变为红棕色知识链接：知识链接：2,4二硝基苯肼二硝基苯肼的性质的性质红色红色结晶性粉末结晶性粉末 分子量分子量 198.14 微溶微溶于水、乙醇，溶于酸于水、乙醇，溶于酸 对眼和皮肤有刺对眼和皮肤有刺激性。对皮肤有致敏性。本品吸收进入激性。对皮肤有致敏性。本品吸收进入体内，可引起高铁血红蛋白血症，出现体内，可引起高铁血红蛋白血症，出现紫绀紫绀 遇明火极易燃烧爆炸。干燥时遇明火极易燃烧爆炸。干燥时经震动、撞击会引起爆炸。燃烧时放出经震动、撞击会引起爆炸。燃烧时放出有毒的刺激性烟雾。与氧化剂混合能形有毒的刺激性烟雾。与氧化剂混合能形成爆炸性混合物。【有害燃烧产物】成爆炸性混合物
7、。【有害燃烧产物】一氧化碳、二氧化碳、氮氧化物一氧化碳、二氧化碳、氮氧化物 -酮戊二酸也能与 2,4二硝基苯肼结合成相应的苯腙，在碱性条件下显色。对实验结果有何影响？ 答：-酮戊二酸因其量不多，加之对520nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线标准曲线作测定时，所用的酶活性单位作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，-酮戊二酸对于结果影响不大，测定结果也比其他比色法（金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）准确。实验试剂：实验试剂：（1）ALT底物液【
8、2 mmol/L-酮戊二酸 , 20 mmol/L丙氨酸】 （2）pH=7.4的PBS（3）丙酮酸标准液2 mmol/L （4）2,4二硝基苯肼溶液【1 mmol/L (5) 0.4 mmol/L NaOHPage 16编号编号01234丙酮酸标准丙酮酸标准液液/mL0.000.050.100.150.20ALT底物液底物液试剂试剂/mL0.500.450.400.350.30PBS(pH=7.4)/mL0.100.100.100.100.102,4二硝基苯肼溶液/mL0.500.500.500.500.50混匀，置混匀，置37摄氏度水浴摄氏度水浴20min0.4mol/L NaOH/mL5.
9、05.05.05.05.0卡门氏单位卡门氏单位0285797150（ 1 ） ALT活活力力的的测测定定标标准准曲曲线线的的制制作作Page 17n混匀，室温混匀，室温10min,蒸馏水调零，蒸馏水调零，520nm比色，绘制标准比色，绘制标准曲线曲线 n (An-A0)n 卡门氏单位n 0 28 57 97 150 青青衣衣测定前将底物液在37C水浴中预温5min（ 2 ）酶酶活活力力测测定定项目项目 T C血清/uL10_ALT底物液/mL0.500.50混匀，置37C水浴保温30min2,4二硝基苯肼溶液/mL0.500.50混匀，置37C水浴保温20min血清/uL_100.4mol/L
10、 NaOH/mL5.005.00Page 19n混匀，室温放置混匀，室温放置10min，以蒸馏水调零，在，以蒸馏水调零，在520nm比色，比色，读取吸光度，以（读取吸光度，以（AT - AC）查标准曲线，即得到血清中）查标准曲线，即得到血清中ALT的酶活力。的酶活力。n参考值：参考值：525卡门氏单位卡门氏单位n注意事项，见书。注意事项，见书。改良赖氏法较赖氏法的优点改改良良赖氏法的反应温度赖氏法的反应温度(40改为改为37)和底物浓度和底物浓度(改为低浓度改为低浓度)的的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效
11、的克服，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶了卓有成效的克服，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性。的真实活性。由于赖氏法设计的底物浓度由于赖氏法设计的底物浓度,如如a-酮戊二酸不足，反应速度只能达酮戊二酸不足，反应速度只能达到最大速度的到最大速度的65%；显色剂；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只及反应液中二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半；保温酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后，新生成的丙酮酸和的酶促反应后，新生成的丙酮酸和未用完的未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题，酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现
12、性较差，在测量精度上仍与连续监测如此等等，使赖氏法的重现性较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。法相差甚大。Page 21思考题（1）NaOH溶液作为终止剂，终止反应。同时也促进显色。溶液作为终止剂，终止反应。同时也促进显色。（2）前面已讲）前面已讲青青衣衣项目项目 TB CS血清/uL10_ALT底物液/mL0.50_0.50丙酮酸标准液0.10ml ALT底物液0.40ml混匀，置37C水浴保温30min2,4二硝基苯肼溶液/mL0.500.500.500.50混匀，置37C水浴保温20min血清/uL_10_0.4mol/L NaOH/mL5.005.005.005.00标标准准对对照照法法 AT-ACALT活力活力= AS-AB 57青青衣衣（4）ALT底物液底物液 2,4-二硝基苯肼二硝基苯肼原因分析：原因分析：ALT底物液的准确性影响到丙酮酸的生成量，底物液的准确性影响到丙酮酸的生成量，继而影响到继而影响到丙酮酸丙酮酸-2,4-二硝基苯腙二硝基苯腙的量，最终影响的量，最终影响ALT活活力的测定。力的测定。2,4-二硝基苯肼二硝基苯肼为红色，过多会影响吸光度的值，过少丙为红色，过多会影响吸光度的值，过少丙酮酸反应不完，也会影响结果。酮酸反应不完，也会影响结果。
