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1、第五章第五章基因工程基本基因工程基本技术技术概述概述一、一、DNA重组技术相关概念重组技术相关概念 克隆克隆(clone)来自于同一始祖的一群相同分子、细来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被成为副本或拷菌、细胞或动物（常被成为副本或拷贝）。贝）。克隆化克隆化(cloning)获取大量单一拷贝的过程，也称获取大量单一拷贝的过程，也称无性无性繁殖繁殖。DNA克隆克隆(DNA cloning)应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子（复复制制子子)-
2、重重组组DNA 。继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含有目的基因的含有目的基因的转化子转化子细胞。细胞。再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分子子的的过过程程称称为为DNA克克隆隆，又又称称为为基基因因克克隆隆(gene cloning)或或 分分 子子 克克 隆隆 (molecular cloning)。 “克隆克隆”某一基因或某一基因或DNA片段过程片段过程中，将外源中，将外源DNA插入载体分子所形成的复插入载体分子所形成的复制子是杂合分子嵌合制子是杂合分子嵌合DNA，所以，所以DNA克克隆隆又称又称重组重组DNA (recombin
3、ant DNA)。 实现实现DNA克隆所用的方法及相关的克隆所用的方法及相关的工作称工作称DNA重组技术重组技术(recombinant DNA technology)，又称，又称基因工程基因工程(genetic engineering)。 基因工程目的：基因工程目的： 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）二、二、DNA重组技术基本程序重组技术基本程序外源外源DNA的获取的获取连接物连接物（重组重组DNA)导入合适导入合适受体细胞受体细胞目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接克隆载体的选择与构建克隆载
4、体的选择与构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 分、切、接、转、筛（一）按功能分类（一）按功能分类（二）按受体细胞分类（二）按受体细胞分类（三）按载体来源分类（三）按载体来源分类一、载体的一、载体的分类分类克隆型载体克隆型载体表达型载体表达型载体原核细胞载体原核细胞载体真核细胞载体真核细胞载体（穿梭载体）（穿梭载体）原核克隆型载体原核克隆型载体原核表达型载体原核表达型载体真核转递型载体真核转递型载体真核表达型载体真核表达型载体质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体病毒载体病毒载体酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体粘性载体粘性载体 细菌培养细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌
5、染色质质粒定义定义: 是存在于细菌是存在于细菌染色体外染色体外的的能独立复制能独立复制的的双链闭环双链闭环的的DNA分子，是能赋予细菌某些特性分子，是能赋予细菌某些特性的辅助性遗传单位。的辅助性遗传单位。二、不同载体的特点与分类二、不同载体的特点与分类（一）质粒载体（一）质粒载体1. 质粒质粒(plasmid)的特征的特征1. 质粒的特征质粒的特征功能：功能： 使宿主细胞具有抵抗不利自身生使宿主细胞具有抵抗不利自身生长因素的能力。长因素的能力。性质：性质：具有不相容性具有不相容性按拷贝数分类：按拷贝数分类： 严谨性（低拷贝）严谨性（低拷贝） 松弛型（高拷贝）松弛型（高拷贝）克隆用质粒载体应具备
6、的特点：克隆用质粒载体应具备的特点：分子相对较小，具有较高的拷贝数分子相对较小，具有较高的拷贝数含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌蛋白质的合成，使质粒的拷贝数增加。蛋白质的合成，使质粒的拷贝数增加。具有多种遗传选择标记，包括各种具有多种遗传选择标记，包括各种抗药抗药基因或营养代谢基因基因或营养代谢基因等。等。2. 质粒载体的分类质粒载体的分类: 克隆载体和表达载体克隆载体和表达载体（1）克隆用质粒）克隆用质粒抗药基因或营养代谢基因抗药基因或营养代谢基因氨苄青霉素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因（ampr）:编码编码-内酰胺酶，水解内酰胺酶，水解amp -内酰胺环使
7、内酰胺环使amp失效失效四环素抗性基因（四环素抗性基因（tetr）：编码转膜泵）：编码转膜泵将将tet从细胞移出从细胞移出大肠杆菌大肠杆菌LacZ基因基因：编码半乳糖苷酶，：编码半乳糖苷酶，分解分解X-gal，使菌落变为，使菌落变为蓝色蓝色。*lac Z N端端146 aa残基编码基因残基编码基因*lac Z编码产物为编码产物为半乳糖苷酶半乳糖苷酶片段片段（N端）端）,突变型突变型lac E. coli可表达该酶的可表达该酶的片段片段（C端端)，两片段单独存在无活性，两片段单独存在无活性 *两端同时存在时有活性两端同时存在时有活性-蓝色化合物蓝色化合物 互补（互补（ complementati
8、on）*在在Lac Z 基因内无外源基因内无外源DNA的插入，在含的插入，在含X-gal的培养基上生长时会出现的培养基上生长时会出现蓝色菌落蓝色菌落-阴性克隆阴性克隆。 *在在Lac Z 基因内插入外源基因内插入外源DNA,在含在含X-gal的培的培养基上生长时会出现养基上生长时会出现白色菌落白色菌落-阳阳性克隆性克隆。 X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶Lac-Z基因基因互补筛选互补筛选-蓝白斑筛选蓝白斑筛选外源外源DNA插入插入白色白色IPTG诱导诱导异丙基异丙基-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷(IPTG)为半乳糖的类为半乳糖的类似物似物互互补筛选法法-（237）阴性克隆阳性克隆AmprORI
9、TetrpBR322质粒质粒：一种克隆质粒ORI：复制起始点，复制起始点，保证高拷贝保证高拷贝自我复制自我复制。结构：结构：Ampr, Tetr：两个抗性基因用于两个抗性基因用于筛选筛选阳性克隆阳性克隆。Pst I, BamH I：两个单酶切位点两个单酶切位点用于插入用于插入目的基目的基因因AmprLacZMCSpfxBlue: 克隆质粒MCS：Multiple Cloning Site提供多个单酶切位点用于克隆操作LacZ: 蓝白斑筛选阳性克隆pUC18/pUC19pUC192686 bpAmprLac ZP(BLA)OriAva I (413)BamHI (418)EcoRI (397)H
10、indIII (448)Pst I (440)Sma I (415)Xma I (413)Apa LI (178)Apa LI (1121)Apa LI (2367)MCS*pUC18/pUC19的的MCS方向方向相反相反pMD-18 T simple克隆载体的结构克隆载体的结构 2. 质粒载体的分类质粒载体的分类:（2）表达用质粒载体：）表达用质粒载体：除具备载体的必备条件外还应有用于除具备载体的必备条件外还应有用于外源基因表达的元件：如启动子、终外源基因表达的元件：如启动子、终止子等止子等分类：分类： 原核表达载体原核表达载体 真核表达载体真核表达载体pET-32a(+)原核表达载体的结构
11、原核表达载体的结构 *pET系列的基本结构：系列的基本结构：T7启动子、启动子、MCS、T7终止子、终止子、Ampr等等Amprlac*可将可将T7 RNA聚合聚合酶基因置于酶基因置于lac启动启动子的控制下子的控制下pcDNA3：真核细胞表达质粒Pcmv：CMV增强子/启动子 驱动目的基因在真核真核细胞细胞内表达BGH pA：加尾信号 目的基因转录后加上polyA尾尾，使其更稳定稳定。（二）（二） 噬菌体噬菌体 A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR 结构区 重组区重组区调控区裂解区cos末端末端 cos 末端末端ARAREcoRI目的基因EcoRIEc
12、oRI插入型置换型 噬菌体作为载体具有两个特点噬菌体作为载体具有两个特点 噬菌体生长繁殖所噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其必需的序列位于其左右二臂左右二臂上，噬菌体基因组中央含有上，噬菌体基因组中央含有30%的的DNA是是 噬菌体生长所非必需的。噬菌体生长所非必需的。 噬菌体的成熟需要噬菌体的成熟需要包装包装，当与外源，当与外源DNA重组后的大小介于原来的重组后的大小介于原来的75%105%之间时，重组的之间时，重组的DNA分子才可包分子才可包装为成熟的噬菌体颗粒。装为成熟的噬菌体颗粒。 噬菌体的种类：噬菌体的种类：Charon系列、系列、 gt系列、系列、EMBL系列系列（三）粘粒载体（三）
13、粘粒载体（cosmid)质粒序列：质粒序列：复制原点，抗性标志复制原点，抗性标志噬菌体：噬菌体：cos粘端序列粘端序列 插入片段插入片段长度长度可以是载体本身长度可以是载体本身长度的的7-10倍倍（四）（四） 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体(YAC)质粒质粒pBR322衍生物衍生物酵母基染色体酵母基染色体中心粒中心粒端粒端粒复制起点顺序复制起点顺序复制起点复制起点(ori)Ampr基因基因组成组成用途用途构建真核生物基因组构建真核生物基因组DNA文库文库能携带更大（能携带更大（1Mb）的插入片段）的插入片段第二节第二节基因工程中常用的工具酶基因工程中常用的工具酶一、限制性核酸内切酶一、限
14、制性核酸内切酶 (restriction endonuclease，RE) 是是能能够够识识别别和和切切割割双双链链DNA内内部部特特定核苷酸序列定核苷酸序列的一类核酸酶。的一类核酸酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H定义：定义：切切基因工程的基因工程的手术刀手术刀、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型） 切切基因工程的基因工程的手术刀手术刀分类：分类：一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶命名：命名：Hin d 属属 种种 株株 序序Haemophilus influenza d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类
15、酶识别序列特点 识别顺序识别顺序一般为一般为46个碱基个碱基，通，通常为常为回文回文结构结构(palindrome)(核苷酸序列呈二元旋转对称核苷酸序列呈二元旋转对称,180反反向重复向重复）切口切口 ：平端切口、粘端切口平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口平头或钝性末端平头或钝性末端（blunt end) 粘性末端粘性末端（sticky end) 产生产生5 突出黏性末端突出黏性末端 (sticky end)EcoR I*GAATTC*
16、CTTAAG*55335533*G*C T T A A 55333355OHP A A T T C* G*55333355P OH 产生产生3 突出黏性末端突出黏性末端Pst I*CTGCAG*GACGTC*5533553355333355OHP*C T G C A*G55333355OHPA C G T C*G*酶单位定义：酶单位定义： 在适当反应条件下，在适当反应条件下，1h内在内在50l体体系中完全酶解系中完全酶解1g特定特定DNA底物所需酶底物所需酶量，定为量，定为1个活性单位。个活性单位。 出售的内切酶几乎均以出售的内切酶几乎均以噬菌体噬菌体DNA作底物测其酶活性单位。作底物测其酶活
17、性单位。酶切鉴定酶切鉴定 ：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳二、二、DNA聚合酶聚合酶含含3种酶活性：种酶活性：1. 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I5 3聚合酶活性聚合酶活性 3 5外切酶活性外切酶活性 5 3外切酶活性外切酶活性催化催化DNA缺口平移反应缺口平移反应,制备制备DNA探针探针(5 3外切酶活性外切酶活性)-主要用途主要用途DNA序列分析序列分析应用：应用：二、二、DNA聚合酶聚合酶2. Klenow片段片段随机引物标记法标记探针随机引物标记法标记探针-主要用主要用途途双脱氧末端终止法进行双脱氧末端终止法进行DNA测序测序cDNA第二链的合成第二链的合成DNA 3突出末端进行末
18、端标记突出末端进行末端标记用途：用途：(大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I大片段，大片段， 缺缺5 3外切酶活性外切酶活性) #38. 323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性DNA聚合酶活性聚合酶活性 N 端端C 端端枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行分子，进行分子生物学研究中常用的工具酶。生物学研究中常用的工具酶。 二、二、DNA聚合酶聚合酶PCR反应反应-主要用途主要用途DNA测序测序用途：用途：3.
19、Taq DNA聚合酶聚合酶(65kD)耐热，耐热， 在在7075时具有最佳的生时具有最佳的生物活性，物活性， 无无3 5外切酶活性外切酶活性(无无校正功能校正功能） #40. 35外切酶活性的功能外切酶活性的功能校读（校读（proofread）功能）功能17/62将错配的核苷酸从引物链的将错配的核苷酸从引物链的3端端除去除去 （1）反转录活性：反转录活性：即以即以RNA为模板合成为模板合成DNA(主）主） （2）RNase H活性：活性：水解水解RNA-DNA中的杂合中的杂合 分子中的分子中的RNA（3）DNA-pol活性：活性：以以DNA为模板合成为模板合成DNA 4. 反转录酶反转录酶(R
20、everse Transcriptase, RT)二、二、DNA聚合酶聚合酶反转录病毒细胞内的逆转录过程反转录病毒细胞内的逆转录过程RNA 模板模板反转录活性反转录活性DNA-RNA 杂杂化双链化双链RNase H活性活性单链单链DNADNA-pol活性活性双链双链DNA三、三、DNA连接酶连接酶(DNA ligase) 基因工程的基因工程的缝纫针缝纫针 *催化双链催化双链DNA相邻碱基相邻碱基5-P和和3-OH间间磷酸二酯键磷酸二酯键形成的酶。形成的酶。*T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶-最常用最常用 催化两个独立催化两个独立DNA片段片段(粘性末端和平末端粘性末端和平末端) 5-P和和3
21、-OH之间形成之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键。*主要功能与用途：主要功能与用途：催化催化平末端平末端连接要比连接要比粘性末端粘性末端 效率低得多。效率低得多。修复双链修复双链DNA分子中单链缺口。分子中单链缺口。四、其他修饰酶四、其他修饰酶功能：功能： 催化多个催化多个脱氧脱氧核苷酸核苷酸依次加到依次加到单链单链或或双链双链DNA分子的分子的3-OH末端。末端。(一一) 末端末端脱氧核苷酸脱氧核苷酸转移酶转移酶(TdT) 用途：用途： 1. 主要作用是在载体或目的基因主要作用是在载体或目的基因 3末末端加上同源端加上同源多聚尾巴多聚尾巴，形成，形成人工粘性人工粘性末端末端，便于，便于DNA重组。
22、重组。2. DNA 3末端的末端的同位素标记同位素标记。催化催化DNA、RNA以及核糖和脱氧核以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的糖三磷酸上的 5 磷酸基团水解磷酸基团水解。用途：用途：1. 在连接反应中去除载体在连接反应中去除载体DNA片段片段5-P，防止载，防止载体自我连接体自我连接.2. 用用32P标记标记5末端时，用此酶去除末端时，用此酶去除5-P，再用，再用激酶进行激酶进行5的的 32P标记标记.(二二) 碱性磷酸酶碱性磷酸酶功能：功能：(三三) 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶(四四) RNase(五五) DNase第三节第三节目的基因的获得和修饰目的基因的获得和修饰-分分一、采用限制性内切酶
23、酶切法直接分采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因离目的基因1.从原核基因组中制备从原核基因组中制备2.从真核基因组中制备从真核基因组中制备二、采用采用PCR或或RT-PCR方法制备目的方法制备目的基因基因1.获得已知的基因获得已知的基因2.构建构建RT-PCR文库法并获得未知基因文库法并获得未知基因3.计算机克隆计算机克隆三、基因组文库或基因组文库或cDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选基因组文库基因组文库(genomic library，G文库文库)： 将基因组将基因组DNA用内切酶消化后插入到适当用内切酶消化后插入到适当载体中，得到含有不同插入片段的克隆载体，载体中，得到含有不同插入片
24、段的克隆载体，再将其导入适当的宿主细胞，再将其导入适当的宿主细胞， 宿主细胞宿主细胞中克隆中克隆载体含有不同的基因组片段，称为基因组文库。载体含有不同的基因组片段，称为基因组文库。G文库构建方法文库构建方法：鸟枪法鸟枪法分离、筛选基因方法分离、筛选基因方法：分子杂交及：分子杂交及探针技术探针技术组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因 cDNA文库文库(cDNA library，C文库文库)： 将细胞内所有将细胞内所有
25、mRNA 逆转录为逆转录为cDNA，再，再将所有将所有cDNA片段克隆到适当的载体中片段克隆到适当的载体中 ，并将并将其导入适当的宿主细胞，宿主细胞中其导入适当的宿主细胞，宿主细胞中含有不同含有不同cDNA片段的克隆载体混合物就是片段的克隆载体混合物就是C文库文库。C文库构建方法文库构建方法： 反转录法合成的反转录法合成的cDNA与合适的载与合适的载体重组并导入宿主细胞而形成的体重组并导入宿主细胞而形成的分离、筛选基因方法分离、筛选基因方法：分子杂交及探分子杂交及探针技术针技术mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体
26、菌 复制复制 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 *由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。四、化学合成法制备基因片段四、化学合成法制备基因片段*已知序列用已知序列用DNA合成仪合成仪 本方法适用于氨基酸残基数目较少的本方法适用于氨基酸残基数目较少的蛋白基因。蛋白基因。缺点：缺点： 2. 如目的基因如目的基因DNA序列需序列需通过氨基酸序通过氨基酸序 列推测列推测，难于保证与，难于保证与天然基因天然基因序列一序列一 致，往往导致致，往往导致表达效率大大降低表达效率大大降低。 1. 只能合成较小片段的只能合成较小片段的DNA四、化学合成法制备基因片段四、化
27、学合成法制备基因片段第四节第四节目的基因的载体连接目的基因的载体连接-接，分子克隆的核心接，分子克隆的核心一、一、PCR产物的克隆策略产物的克隆策略（一）限制性内切酶酶切位点添加法（一）限制性内切酶酶切位点添加法*利用目的片段所特有的限制性内切利用目的片段所特有的限制性内切酶识别位点对产物进行酶切分析。酶识别位点对产物进行酶切分析。*在设计在设计PCR引物时要考虑到连接方引物时要考虑到连接方式，直接在引物的末端包含与载体式，直接在引物的末端包含与载体相匹配的限制性内切酶位点。相匹配的限制性内切酶位点。(二）二）T/A克隆法克隆法 *PCR产物的产物的3末端加一个末端加一个A的粘性端，的粘性端，
28、将其直接克隆至将其直接克隆至3粘性末端含一个粘性末端含一个T的的线性克隆载体中。线性克隆载体中。35T载体载体35载体载体T3535AAPCR产物产物一、一、PCR产物的克隆策略产物的克隆策略TA克隆方法克隆方法(一步一步PCR克隆克隆)PCR扩增扩增+335PCR产物产物AA5T载体载体TT5533连接连接转化转化蓝白筛选蓝白筛选校正聚合酶校正聚合酶平端平端PCR产物产物Taq酶酶dATP*不需酶切不需酶切*不受酶切不受酶切位点的限制位点的限制（一）粘性末端连接法（一）粘性末端连接法用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因适用于插适用于插入片段和入片段和载体具有载体具有相同相
29、同的粘的粘性末端性末端高背景高背景(自身环自身环化化)双向双向(正、反正、反)插插入入单单酶酶切切缺陷缺陷二、外源二、外源DNA片段和载体的连接片段和载体的连接#58. Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶16C 16 hGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体目的基因目的基因自连自连载体载体自连自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接如何实现？如何实现？（二）平头末端连接法（二）平头末端连接法质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1目的基因重组质粒
30、产生粘性末端的内切酶核酸酶S1 本法适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同的酶切位点！（三）人工接头法（三）人工接头法用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因+DNA连接酶接头(linker) 本法适用于在质粒和本法适用于在质粒和目的基因上目的基因上没有相同没有相同的的酶切位点酶切位点由平端加上新的酶切位点，再用限制酶由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端而进行粘端连接切除产生粘性末端而进行粘端连接。 （四）同聚物接尾法（四）同聚物接尾法DNA连接酶重组质粒质粒目的基因内切酶末端转移酶 +dGTP末端转移酶 +dCTP 本法适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同
31、的酶切位点第五节第五节重组分子的扩增和鉴定重组分子的扩增和鉴定一、重组一、重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞-转转宿主细胞或受体细胞：宿主细胞或受体细胞：定义定义：被导入重组：被导入重组DNA分子的细胞。分子的细胞。分类：分类： 原核细胞：原核细胞：大肠杆菌大肠杆菌、链霉菌、链霉菌 及枯草杆菌及枯草杆菌 真核细胞：真核细胞：酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞要求：要求： 容易接纳重组容易接纳重组DNA分子分子 对载体的复制扩增无严格限制对载体的复制扩增无严格限制 不存在特异的能降解外源不存在特异的能降解外源DNA的内切酶的内切酶 不对外源不对外源DNA进行修饰进行
32、修饰重组重组DNA分子导入方式：分子导入方式：转化转化(transformation) 将重组将重组DNA分子导入分子导入原核细胞原核细胞的过程。的过程。转染（转染（transfection)将重组将重组DNA分子导入分子导入真核细胞真核细胞的过程。的过程。感染（感染（infection）以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组组DNA，经，经体外包装体外包装成具有成具有感染性感染性的噬菌体的噬菌体或病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白或病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组将重组DNA注入原核或真核细胞，使目的基注入原核或真核细胞，使目的基因得以
33、繁殖的过程。因得以繁殖的过程。转化转化(transformation)转化的关键转化的关键：感受态细胞的制备：感受态细胞的制备感受态细胞（感受态细胞（competent cell）：经理经理化方法处理而容易接收外源化方法处理而容易接收外源DNA分子分子的细胞。的细胞。转化的方法：转化的方法：化学法（化学法（ CaCl2 法法）：需感受态细胞：需感受态细胞电穿孔法：不需感受态细胞电穿孔法：不需感受态细胞转化效率较高转化效率较高但需特殊仪器但需特殊仪器基因导入装置基因导入装置(Bio-Rad)BTX ECM 2001多功多功能细胞融合仪能细胞融合仪 转染（转染（transfection) 分类：分
34、类：瞬时转染瞬时转染 稳定转染：稳定转染：G418（Geneticin)方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 电穿孔法电穿孔法 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 非转化子非转化子转化子转化子非重组体非重组体重组体重组体鉴定鉴定单抗生素筛选单抗生素筛选非转化子非转化子( (不能生长）不能生长）转化子转化子阳性重组体阳性重组体自身环化载体自身环化载体未酶解完全载体未酶解完全载体非目的基因插入载体非目的基因插入载体二、重组二、重组DNA分子的筛选、鉴定分子的筛选、鉴定（一）抗生素筛选（一）抗生素筛选仅作为初步筛选仅作为初步筛选AmprTetr插入失活的双抗生素
35、对照筛选法*若目的基因插入抗若目的基因插入抗生素抗性基因生素抗性基因外部外部，重组质粒重组质粒能能在含该抗在含该抗生素的培养基上生长生素的培养基上生长*若目的基因插入若目的基因插入抗生素抗性基因抗生素抗性基因内内部部，即引起，即引起插入失插入失活活，重组质粒，重组质粒不能不能在含该抗生素的培在含该抗生素的培养基上生长养基上生长BamH IDNA连接酶重组质粒目的基因AmprTetrPst I目的基因与目的基因与pBR322经经BamH I酶切后进行重组酶切后进行重组如何筛选得到阳性克隆？如何筛选得到阳性克隆？思考题思考题用BamH I酶切( (插插入入失失活活法法) ) 抗抗药药性性标标记记选
36、选择择在在tetr（TcR)中插入外源中插入外源DNAampr插入失活的双抗生素对照筛选法克隆克隆3,5,7,9,10 是是阳性克隆阳性克隆TetTet平板平板123456789101112123456789101112AmpAmp转化子转化子非转化子非转化子(不能生长不能生长)插入失活筛选法插入失活筛选法(120)(三）酶切电泳鉴定三）酶切电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳限制性内切酶限制性内切酶酶切鉴定酶切鉴定快速小量提取质粒快速小量提取质粒DNA跑得跑得慢慢-重组质重组质粒粒跑得跑得快快-空载体空载体（二）（二）X-gal筛选筛选-蓝蓝/白白筛选筛选 见于见于pUC系列、系列、 pEG
37、M系列、系列、M13蓝色菌落：阴性克隆蓝色菌落：阴性克隆 白色菌落：阳性克隆白色菌落：阳性克隆 #75 互互补补利用利用互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18 重组重组CK2 亚基转化子的筛选亚基转化子的筛选 第第1,2,3,5,7,9,10,11,12,13号克隆是阳性克隆号克隆是阳性克隆; 第第4,6,8号是阴性克隆号是阴性克隆1. DNA/EcoR I+Hind 2. recombinant plasmid /Nde I+Hind III3. recombinant plasmid /Hind III 4. pT7-7/ Hind III 重组质粒的酶切鉴定重组质粒的酶切鉴定（四
38、）序列分析（四）序列分析 *通常采用多克隆酶切位点两端的载体序列通常采用多克隆酶切位点两端的载体序列作为测序时引物的结合位点作为测序时引物的结合位点-通用引物通用引物 *对于对于表达型表达型重组子，插入片段必须是正确重组子，插入片段必须是正确的序列，一般要进行的序列，一般要进行DNA测序测序ABI PRISM 310型型 DNA测序仪测序仪主要用于DNA序列分析PE 3700型型DNA测序仪测序仪（五）其他方法（五）其他方法内切酶内切酶重组重组DNA目的基因目的基因分离分离电泳电泳印迹到印迹到NC膜膜探针探针放射性放射性非放射性非放射性分子杂交分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交覆盖滤膜取下沾有菌
39、落的滤膜 裂解、 变性、固定等与探针杂交放射性自显影1 2 34 5 63 3和和5 5是阳性克隆是阳性克隆菌落或噬菌斑原位杂交菌落或噬菌斑原位杂交菌落印迹杂交菌落印迹杂交 (603)SDS-PAGE purified recombinant human CK2 subunit and Western blot用已知的特异抗体检测目的基因蛋白免疫化学检测（免疫化学检测（Western blot)重组重组DNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为： 小结小结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受
40、体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因文库基因文库 内切酶内切酶化学合成化学合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主鉴定鉴定（酶切电泳、序列分析、杂交、酶切电泳、序列分析、杂交、Western blot等）等）筛选筛选 (抗生素、抗生素、X-gal 等法等法)阳性重组体阳性重组体第六节第六节 外源基因的表达外源基因的表达表达体系的建立表达体系的建立:
41、 :表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化 外源基因的表达涉及目的基因外源基因的表达涉及目的基因的的克隆克隆、复制、转录、翻译、蛋白、复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程质产物的加工及分离纯化等过程 一、外源基因在原核系统中的表达一、外源基因在原核系统中的表达 大肠杆菌（大肠杆菌（E.coli）表达体系最常用）表达体系最常用表达载体：表达载体：选择标志、多克隆位点选择标志、多克隆位点 强启动序列、翻译调控序列强启动序列、翻译调控序列优点：优点： 培养方法简单、迅速、经济而又适培养方法简单、迅速、经济而又适合大规模生产。合大规模
42、生产。 原核表达系统的不足原核表达系统的不足 只适合表达克隆的只适合表达克隆的cDNA，不宜表达真核不宜表达真核基因组基因组DNA 表达的真核蛋白不能形成正确的折叠和进表达的真核蛋白不能形成正确的折叠和进行修饰行修饰 真核蛋白常以无生物活性的真核蛋白常以无生物活性的包涵体形式包涵体形式存存在在 难以实现大量表达分泌性蛋白难以实现大量表达分泌性蛋白 真核蛋白不稳定，易被细菌蛋白酶降解真核蛋白不稳定，易被细菌蛋白酶降解 原核细胞周质中常含有种类繁多的内毒素原核细胞周质中常含有种类繁多的内毒素 真核表达系统真核表达系统是指在真核细胞中是指在真核细胞中表达外源基因的体系。表达外源基因的体系。主要有：主
43、要有：酵母、哺乳动物、昆虫细胞酵母、哺乳动物、昆虫细胞（杆状病毒）系统和高等植物系统（杆状病毒）系统和高等植物系统二、外源基因在真核细胞中的表达二、外源基因在真核细胞中的表达（一）真核表达系统的优缺点（一）真核表达系统的优缺点优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA或真核基因组或真核基因组DNA 可进行糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰可进行糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰某些真核细胞可将外源基因表达产物直某些真核细胞可将外源基因表达产物直接分泌至细胞培养基中接分泌至细胞培养基中 缺点：缺点： 操作技术难、费时、费钱操作技术难、费时、费钱（二）真核表达载体（二）真核表达载体大多是大多是穿梭载体穿梭载
44、体含有原核克隆载体的含有原核克隆载体的复制子、抗性筛复制子、抗性筛选基因和选基因和MCS等序列等序列含有真核细胞的含有真核细胞的启动子、增强子、剪启动子、增强子、剪接信号、转录终止信号和接信号、转录终止信号和PolyA化信化信号及遗传选择标记号及遗传选择标记等组件等组件（三）外源基因导入和转染细胞的筛选（三）外源基因导入和转染细胞的筛选外源基因导入真核细胞的方法外源基因导入真核细胞的方法 病毒感染（天然方法病毒感染（天然方法 ） 载体转染载体转染 （化学或物理方法（化学或物理方法 ）常用的筛选方法有常用的筛选方法有1. 新霉素抗性选择系统新霉素抗性选择系统 2. 胸苷激酶基因胸苷激酶基因HAT
45、选择系统选择系统 3. 二氢叶酸还原酶基因选择系统二氢叶酸还原酶基因选择系统 课堂讨论内容（课堂讨论内容（1）结合自己的专业和研究课题，结合自己的专业和研究课题，选择一感兴趣的目的基因，试选择一感兴趣的目的基因，试述如何利用所学的述如何利用所学的DNA体外重体外重组技术组技术克隆出该基因（简述设克隆出该基因（简述设计方法）。计方法）。课堂讨论内容（课堂讨论内容（2）结合自己的专业和研究课题，选结合自己的专业和研究课题，选择一感兴趣的目的基因，利用所择一感兴趣的目的基因，利用所学的学的基因工程技术基因工程技术知识，试述在知识，试述在原核细胞中如何获得该目的基因原核细胞中如何获得该目的基因的大量蛋
46、白表达产物（请简述设的大量蛋白表达产物（请简述设计方案）。计方案）。 -生化研究生生化研究生课堂讨论内容（课堂讨论内容（3）两位研究者同步通过两位研究者同步通过RT-PCR获得目的片获得目的片段，鉴定并纯化后利用段，鉴定并纯化后利用pBS-T 载体连接试载体连接试剂盒进行重组剂盒进行重组DNA的构建，在转化后进行的构建，在转化后进行平板筛选，结果一组未在含平板筛选，结果一组未在含Amp的的LB平平皿上长出菌落；另一组从含皿上长出菌落；另一组从含Amp的的LB平平皿上挑选单菌落，提取质粒皿上挑选单菌落，提取质粒DNA后进行限后进行限制性内切酶酶切鉴定时却制性内切酶酶切鉴定时却未在琼脂糖凝胶未在琼脂糖凝胶电泳中见到酶切的目的电泳中见到酶切的目的DNA片段片段，请分析，请分析原因并提出可行的解决方法。原因并提出可行的解决方法。
