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1、人体疟原虫镜检技术沈毓祖沈毓祖安徽省疾病预防控制中心安徽省疾病预防控制中心一、概述一、概述 疟原虫属原生动物亚界的单细胞真核生物。疟原虫属原生动物亚界的单细胞真核生物。在生物界的位置：疟原虫为原生动物门、孢子在生物界的位置：疟原虫为原生动物门、孢子纲、血孢子目、疟原虫科、疟原虫属。疟原虫纲、血孢子目、疟原虫科、疟原虫属。疟原虫有有149149种，自然界感染人体的疟原虫只有四种：种，自然界感染人体的疟原虫只有四种：即间日疟（即间日疟（PvPv）、恶性疟（）、恶性疟（PfPf）、三日疟）、三日疟（PmPm）、蛋形疟（）、蛋形疟（PoPo）四种。）四种。二、疟原虫生活史二、疟原虫生活史1、红细胞外期
2、、红细胞外期2 2、红细胞内期、红细胞内期3 3、子孢子增殖期、子孢子增殖期周围血液中各种血细胞的形态周围血液中各种血细胞的形态薄血膜疟原虫形态特征薄血膜疟原虫形态特征1、间日疟：环状体、滋养体、裂殖体、配子体2、恶性疟：环状体、配子体小滋养体（环状体）小滋养体（环状体）间日疟间日疟恶性疟恶性疟约为红细胞直径的约为红细胞直径的1/3,1/3,环环较粗大；核较粗大；核1 1个，个，2 2个核和个核和一个红细胞寄生一个红细胞寄生2 2个环状个环状体不如恶性疟原虫多见。体不如恶性疟原虫多见。约为红细胞的约为红细胞的1/61/6；环纤；环纤细，核细，核1 12 2个，一个红细个，一个红细胞寄生胞寄生2
3、 2个环状体的常见。个环状体的常见。薄血膜间日疟环状体薄血膜间日疟环状体服药后形态改变的间日疟原虫服药后形态改变的间日疟原虫薄血膜间日疟环状体薄血膜间日疟环状体恶性疟薄血膜环状体恶性疟薄血膜环状体薄血膜恶性疟环状体薄血膜恶性疟环状体薄血膜恶性疟环状体薄血膜恶性疟环状体三日疟原虫环状体三日疟原虫环状体卵形疟原虫环状体卵形疟原虫环状体大滋养体大滋养体间日疟间日疟恶性疟恶性疟虫体不规则，较大；阿米虫体不规则，较大；阿米巴样，空泡明显；疟色素巴样，空泡明显；疟色素细小，黄褐色。细小，黄褐色。较小，圆形；空泡小；早较小，圆形；空泡小；早期疟色素细小，金黄色，期疟色素细小，金黄色，晚期结成块状，黄褐色。晚
4、期结成块状，黄褐色。间日疟滋养体间日疟滋养体薄血膜间日疟滋养体薄血膜间日疟滋养体薄血膜间日疟滋养体薄血膜间日疟滋养体间日疟环状体、滋养体、间日疟环状体、滋养体、三日疟滋养体（呈带状）三日疟滋养体（呈带状）裂殖体前期裂殖体前期间日疟间日疟恶性疟恶性疟圆形或不规则，核分裂为圆形或不规则，核分裂为2 2个以上，空泡消失；疟个以上，空泡消失；疟色素分布不匀。色素分布不匀。圆形，核分裂为圆形，核分裂为2 2个以上；个以上；疟色素集成团块。疟色素集成团块。薄血膜间日疟未成熟裂殖体薄血膜间日疟未成熟裂殖体裂殖体裂殖体间日疟间日疟恶性疟恶性疟大于正常红细胞；裂殖子大于正常红细胞；裂殖子12122424个，通常
5、个，通常1616个，排个，排列不规则，疟色素常集于列不规则，疟色素常集于一侧，黄褐色。一侧，黄褐色。小于正常红细胞；裂殖小于正常红细胞；裂殖子较小，子较小，8 82626个，通常个，通常8 81818个，排列不规则，个，排列不规则，疟色素成团块状，黑褐疟色素成团块状，黑褐色。色。薄血膜间日疟成熟裂殖体薄血膜间日疟成熟裂殖体薄血膜间日疟成熟裂殖体薄血膜间日疟成熟裂殖体薄血膜间日疟成熟裂殖体薄血膜间日疟成熟裂殖体卵形疟卵形疟雌配子体雌配子体间日疟间日疟恶性疟恶性疟大于正常红细胞，圆形；大于正常红细胞，圆形；核小，致密，深红色，偏核小，致密，深红色，偏于一侧，胞浆深蓝色；疟于一侧，胞浆深蓝色；疟色素
6、散在。色素散在。新月形，两端较尖；核小，新月形，两端较尖；核小，致密，深红色，位于中央；致密，深红色，位于中央；胞浆深蓝色；疟色素围于胞浆深蓝色；疟色素围于核周。核周。雄配子体雄配子体间日疟间日疟恶性疟恶性疟大于正常红细胞，圆形；大于正常红细胞，圆形；核大，疏松，浅红色，多核大，疏松，浅红色，多位于中央；胞浆浅蓝色或位于中央；胞浆浅蓝色或淡红色；疟色素散在。淡红色；疟色素散在。腊肠形，两端钝圆，核大，腊肠形，两端钝圆，核大，疏松，淡红色，位于中央；疏松，淡红色，位于中央；胞浆浅蓝色或浅红色；疟胞浆浅蓝色或浅红色；疟色素位于核周。色素位于核周。薄血膜配子体薄血膜配子体薄血膜配子体薄血膜配子体恶性
7、疟配子体恶性疟配子体恶性疟配子体恶性疟配子体恶性疟配子体恶性疟配子体大配子体与大滋养体的形态区别大配子体与大滋养体的形态区别间日疟间日疟2 2、厚血膜上疟原虫形态特征、厚血膜上疟原虫形态特征. . 环状体（环状体（R R）. . .间日疟环状体间日疟环状体. . .恶性疟环状体恶性疟环状体. . 滋养体（滋养体（T T）. . .间日疟滋养体间日疟滋养体. . .恶性疟滋养体恶性疟滋养体. . 早期裂殖体（早早期裂殖体（早S S）. . .间日疟裂殖体间日疟裂殖体. . .恶性疟裂殖体恶性疟裂殖体. . 晚期裂殖体晚期裂殖体. . .间日疟晚期裂殖体间日疟晚期裂殖体. . .恶性疟恶性疟晚期裂
8、殖体晚期裂殖体厚血膜间日疟原虫形态厚血膜间日疟原虫形态厚血膜间日疟原虫形态厚血膜间日疟原虫形态厚血膜间日疟原虫形态厚血膜间日疟原虫形态厚血膜间日疟原虫形态厚血膜间日疟原虫形态厚血膜间日疟滋养体厚血膜间日疟滋养体间日疟环状体间日疟环状体图图注注：本本片片上上、下下、左左、右右各各有有一一个个疟疟原原虫虫。上上、右右、左左均均为为大大小小不不同同的的环环状状体体；下下为为大大滋滋养养体体，虫虫体体已已断断裂裂成成数数块块，但但可可见见有有薛薛氏氏点点的的红红细细胞胞残残骸骸间间日日疟疟本片中部有两个白细胞，在其左上方、左下方各有一个大滋养体；其右上方有两个大滋养本片中部有两个白细胞，在其左上方、左
9、下方各有一个大滋养体；其右上方有两个大滋养体，胞浆皆已绉缩成数块，但皆有红细胞残骸可见体，胞浆皆已绉缩成数块，但皆有红细胞残骸可见间日疟间日疟虫体位于本片中部，胞浆皱缩为多块，色素聚集于虫体右上方；本虫上方为一个大滋养体虫体位于本片中部，胞浆皱缩为多块，色素聚集于虫体右上方；本虫上方为一个大滋养体滋养体滋养体裂殖体裂殖体间日疟间日疟厚血膜恶性疟环状体厚血膜恶性疟环状体厚血膜间日疟原虫形态厚血膜间日疟原虫形态7个环状体散在于个环状体散在于5个白细胞之间，每个虫体可见一个红色的核和蓝色断裂的或皱缩的原浆个白细胞之间，每个虫体可见一个红色的核和蓝色断裂的或皱缩的原浆恶性疟恶性疟.配子体（配子体（G）
10、 2.5.1间日疟配子体间日疟配子体 2.5.1.1 完整的配子体完整的配子体 2.5.1.2 浆裂断收缩，核与色素如常浆裂断收缩，核与色素如常 2.5.1.3 浆已腐蚀消失，仅有核与色素浆已腐蚀消失，仅有核与色素 2.5.1.4 核消失，仅有浆与色素核消失，仅有浆与色素 2.5.l.5 核浆均已消失。仅有色素颗粒，以其沿边分布核浆均已消失。仅有色素颗粒，以其沿边分布 的特点即可确认的特点即可确认 2.5.2 恶性疟配子体恶性疟配子体 2.5.2.1 正常配子体正常配子体 2.5.2.2 圆形配子体圆形配子体 2.5.2.3 梭形（枪形）配子体梭形（枪形）配子体 2.5.2.4 腐蚀的配子体腐
11、蚀的配子体厚血膜恶性疟配子体厚血膜恶性疟配子体四、疟原虫与其它物体的鉴别四、疟原虫与其它物体的鉴别1. 血小板血小板2. 染液残渣染液残渣3. 幼红细胞残骸幼红细胞残骸4. 白细胞的破碎残骸白细胞的破碎残骸5. 疑似原虫胞浆疑似原虫胞浆6. 疑似疟色素疑似疟色素7. 疑似疟原虫核疑似疟原虫核五、镜检工作所需注意的事项五、镜检工作所需注意的事项1 1、在镜检中显微镜的使用：油镜、凹镜、视野需按一宝、在镜检中显微镜的使用：油镜、凹镜、视野需按一宝顺序逐个检查。顺序逐个检查。 2 2、疟原虫镜检工作中，凡是发热病人。疟疾、疑似疟疾、疟原虫镜检工作中，凡是发热病人。疟疾、疑似疟疾、及不明原因的发热病人
12、均需进行疟原虫镜检。及不明原因的发热病人均需进行疟原虫镜检。 3 3、做好镜检登记：凡是镜检疟原虫的均需如实登记，阴、做好镜检登记：凡是镜检疟原虫的均需如实登记，阴、阳性片保存待考核。阳性片保存待考核。 4 4、每一个月上报一次镜检数。包括镜检人数、阳性、阴、每一个月上报一次镜检数。包括镜检人数、阳性、阴性。性。5 5、如发现恶性疟以嘴快的通信方法，在、如发现恶性疟以嘴快的通信方法，在2424小时内报县、小时内报县、市、省疾病预防控制机构，阳性血片留待上级复核。市、省疾病预防控制机构，阳性血片留待上级复核。 六、血片制作与染色六、血片制作与染色1 1、血片的清洁、血片的清洁 新的载皮片必须洗洁
13、净后才可直接浸于新的载皮片必须洗洁净后才可直接浸于 95%95%的酒精中，的酒精中，然后一一取出，用软而洁净并没有棉花毛的细布擦干，然后一一取出，用软而洁净并没有棉花毛的细布擦干，擦亮，妥善放置，勿使灰尘沾污。擦亮，妥善放置，勿使灰尘沾污。 用过的载玻片可用用过的载玻片可用5 5之煮沸肥皂水洗涤，将玻片一之煮沸肥皂水洗涤，将玻片一张一张的放入其中待肥皂水稍冷后，用毛刷或纱布细张一张的放入其中待肥皂水稍冷后，用毛刷或纱布细心拭擦。再用清水漂洗干净并以纱布擦干，然后浸于心拭擦。再用清水漂洗干净并以纱布擦干，然后浸于 9595酒精内脱脂，照上述法处理，酒精内脱脂，照上述法处理， 亦可用洗涤液清洗，在
14、整个擦洗过程中，应注意避免亦可用洗涤液清洗，在整个擦洗过程中，应注意避免玻片互相磨擦，而使玻片面磨毛，以致不堪使用。玻片互相磨擦，而使玻片面磨毛，以致不堪使用。采血的部位和方法采血的部位和方法 l以耳垂采血为主。以耳垂采血为主。l以以75%75%酒精棉球消毒耳垂待酒精干后，左酒精棉球消毒耳垂待酒精干后，左手拇指和食指紧捏耳垂，右手持一次性手拇指和食指紧捏耳垂，右手持一次性采血针迅速刺入，适可而止第一滴血不采血针迅速刺入，适可而止第一滴血不必擦掉，即可应用。（若由指头取血则必擦掉，即可应用。（若由指头取血则受检者痛楚较大，且易引起创口感染，受检者痛楚较大，且易引起创口感染，一投不宜采用。）一投不
15、宜采用。）采血的血量采血的血量l厚血膜血量约为厚血膜血量约为5 5立方毫米左右立方毫米左右( (即一小即一小滴滴) )，涂成边缘光滑之园形，直径约，涂成边缘光滑之园形，直径约0.80.81.01.0厘米左右。厘米左右。l薄血膜血量只需薄血膜血量只需0.5-1.00.5-1.0立方毫米左右立方毫米左右, ,过多则血膜过厚过大。薄膜宜涂成舌状过多则血膜过厚过大。薄膜宜涂成舌状长约长约2.52.5厘米，宽约厘米，宽约2 2厘米厘米采血的时间采血的时间l进行疟疾普查时，在同一时间内常常需进行疟疾普查时，在同一时间内常常需要检查很多居民，故一般无法考虑取血要检查很多居民，故一般无法考虑取血的时间。的时间
16、。l但在诊断临床的疟疾患者时，就应当考但在诊断临床的疟疾患者时，就应当考虑在什么时候取血较为适宜，尤在确定虑在什么时候取血较为适宜，尤在确定不下虫种和查不到疟原虫的疑似疟疾患不下虫种和查不到疟原虫的疑似疟疾患者的情况下。者的情况下。采血的时间采血的时间-间日疟间日疟l间日疟原虫及三日疟原虫，在患者刚发冷发热间日疟原虫及三日疟原虫，在患者刚发冷发热以后，大部是在环状滋养体期，故这一时期区以后，大部是在环状滋养体期，故这一时期区别疟原虫种类是不容易的。虽在别疟原虫种类是不容易的。虽在般情况下，般情况下，随便什么时间检查感染者的末稍血液随便什么时间检查感染者的末稍血液, ,多少能多少能查到各个时期的
17、原虫，但查到各个时期的原虫，但适当的取血时间适当的取血时间，一，一般是在患者般是在患者发作数小时至十余小时发作数小时至十余小时，即已滋养，即已滋养发育至具有易于鉴别的晚期滋养体期发育至具有易于鉴别的晚期滋养体期采血的时间采血的时间-恶性疟恶性疟l恶性疟原虫，从理论上说，因为恶性原虫的裂体生殖恶性疟原虫，从理论上说，因为恶性原虫的裂体生殖是在内脏的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患是在内脏的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患者的末稍血液中不易查到。但实际情况不尽如此，一者的末稍血液中不易查到。但实际情况不尽如此，一般在受染者的末稍血液中，随时能见到少数恶性疟原般在受染者的末稍血液中，随时能见
18、到少数恶性疟原虫的环状滋养体，虫的环状滋养体，l虽然如此，较理想的取血时间，是在发作后的虽然如此，较理想的取血时间，是在发作后的2020小时小时左右，因为这个时候，环状滋养体虽已滋长发育至最左右，因为这个时候，环状滋养体虽已滋长发育至最高峰，但尚未回至内脏的毛细血管中去进行裂体生殖。高峰，但尚未回至内脏的毛细血管中去进行裂体生殖。l环状滋养体的数量与构造，有助于疟原虫种类的鉴别。环状滋养体的数量与构造，有助于疟原虫种类的鉴别。恶性疟原虫的配子体很易识别，但在初发时，一般需恶性疟原虫的配子体很易识别，但在初发时，一般需要在发作八日后才能在末稍血液中出现，应当注意要在发作八日后才能在末稍血液中出现
19、，应当注意厚、薄血膜的形状和位置厚、薄血膜的形状和位置l薄血膜宽薄血膜宽2cm，长，长2.5cml厚血膜直径厚血膜直径0.8-1cml假定将玻片划成三格等分，则厚血膜应位于中假定将玻片划成三格等分，则厚血膜应位于中格靠右侧线处，薄血膜则从玻片中央起至左格格靠右侧线处，薄血膜则从玻片中央起至左格中部止，右端空格供记录姓名，编号或贴标签中部止，右端空格供记录姓名，编号或贴标签之用之用(如图如图)标签血片的制作血片的制作1 1l玻片的执持方法：玻片的执持方法： 无论在拭擦玻片，制作血片或染无论在拭擦玻片，制作血片或染色血片时，手指仅可夹持玻片两侧色血片时，手指仅可夹持玻片两侧缘，切匆触及玻片之上下面
20、以免手缘，切匆触及玻片之上下面以免手上油脂污及玻片面，使薄血涂布不上油脂污及玻片面，使薄血涂布不匀，厚血膜易于脱落匀，厚血膜易于脱落4、厚血膜涂制、厚血膜涂制l取洁净的载玻片和推片各一张载玻片放桌上，推片以右手取洁净的载玻片和推片各一张载玻片放桌上，推片以右手拇指和食指持其二侧，以左端下角从受检者之耳垂沾取血拇指和食指持其二侧，以左端下角从受检者之耳垂沾取血滴，在载玻片之适当位置，滴，在载玻片之适当位置， 自内向外回转扩大，涂成厚自内向外回转扩大，涂成厚血膜，使厚薄均匀。涂毕后用干棉球拭掉推片上和耳垂上血膜，使厚薄均匀。涂毕后用干棉球拭掉推片上和耳垂上之残留小量血液。之残留小量血液。血片的制作
21、血片的制作- -厚血膜涂制厚血膜涂制l取洁净的载玻片和推片各一张载玻片放桌上，取洁净的载玻片和推片各一张载玻片放桌上，推片以右手拇指和食指持其二侧，以左端下角推片以右手拇指和食指持其二侧，以左端下角从受检者之耳垂沾取血滴，在载玻片之适当位从受检者之耳垂沾取血滴，在载玻片之适当位置，置， 自内向外回转扩大，涂成厚血膜，使厚自内向外回转扩大，涂成厚血膜，使厚薄均匀。涂毕后用干棉球拭掉推片上和耳垂上薄均匀。涂毕后用干棉球拭掉推片上和耳垂上之残留小量血液。之残留小量血液。血片的制作血片的制作-薄血膜涂制薄血膜涂制l以推片左端中央沾取薄血膜所需之血，与载玻以推片左端中央沾取薄血膜所需之血，与载玻片约成片
22、约成2525一一4545度角，使血滴向二旁扩展至一定度角，使血滴向二旁扩展至一定宽度时，立即向左边轻轻迅速推出即成薄血膜。宽度时，立即向左边轻轻迅速推出即成薄血膜。推时速度之快慢和角度均影响血膜的厚薄程度，推时速度之快慢和角度均影响血膜的厚薄程度，最理想的薄血膜是一层血细胞，血细胞的分布最理想的薄血膜是一层血细胞，血细胞的分布排列比较均匀。无裂缝，无空隙。排列比较均匀。无裂缝，无空隙。血片的编号血片的编号l血片编号可根据实际操作进行。血片编号可根据实际操作进行。l号码必须不易脱落，建议用铅笔在薄血膜上编号码必须不易脱落，建议用铅笔在薄血膜上编号。号。血片的固定和脱膜血片的固定和脱膜l薄血膜用甲
23、醇固定薄血膜用甲醇固定l现场检查的血片厚血膜可以不脱血膜，直接染现场检查的血片厚血膜可以不脱血膜，直接染色。色。l保存时间较长的标本片厚血膜要脱血膜后保存。保存时间较长的标本片厚血膜要脱血膜后保存。血片染色前保存的注意事项血片染色前保存的注意事项l平放、平放、 有盖、有盖、 防止灰、尘和植物孢子污染。防止灰、尘和植物孢子污染。l防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸l自然干燥，不能太阳晒和火烤自然干燥，不能太阳晒和火烤制作血片的注意事项制作血片的注意事项l制成的血片切勿用火烤、日晒或放在新购置之标本盒制成的血片切勿用火烤、日晒或放在新购置之标本盒内，以免血红蛋白凝固无法脱除。血片放置
24、待干时不内，以免血红蛋白凝固无法脱除。血片放置待干时不可倾斜，否则厚血膜中血细可倾斜，否则厚血膜中血细 胞沉在一边，可使厚薄胞沉在一边，可使厚薄不匀。此外还要防止苍蝇吮吸血膜和灰尘污染血片。不匀。此外还要防止苍蝇吮吸血膜和灰尘污染血片。l 制成的血膜须完全干燥后制成的血膜须完全干燥后( (自然情况下约自然情况下约4-124-12小时才小时才能全干燥；必要时，可置于能全干燥；必要时，可置于3 73 7的暖箱中，促其速的暖箱中，促其速干干) )始可进行固定及染色否则薄血膜中的红细胞边缘始可进行固定及染色否则薄血膜中的红细胞边缘皱缩，厚血膜容易在染色时脱落，而常现网状的背景；皱缩，厚血膜容易在染色时
25、脱落，而常现网状的背景；反之；血片搁置过久则有霉菌及枯草杆菌生长，血红反之；血片搁置过久则有霉菌及枯草杆菌生长，血红蛋白凝固，也不能使用，因此不利于镜检。蛋白凝固，也不能使用，因此不利于镜检。l若把未经固定的血片能盛于氯化钙的干燥器内，然后若把未经固定的血片能盛于氯化钙的干燥器内，然后放入冰箱中，可保存放入冰箱中，可保存3 3年之久，并仍可较满意的染色。年之久，并仍可较满意的染色。血片的染色血片的染色l吉氏染液的成份吉氏染液的成份l原料：吉氏染粉原料：吉氏染粉 10 g10 g 中性甘油中性甘油 500 ml500 ml 纯甲醇纯甲醇 500 ml500 ml吉氏液染色方法吉氏液染色方法将吉氏染液配成将吉氏染液配成3%3%的稀释液的稀释液水水97 ml + 3 ml97 ml + 3 ml吉氏液吉氏液 PH7.0-7.2PH7.0-7.2染色染色25253030分钟分钟影响染色效果的因素影响染色效果的因素l染料和溶剂的质量染料和溶剂的质量l染液的新旧染液的新旧l染液稀释后的使用时间染液稀释后的使用时间l染液的稀释浓度染液的稀释浓度l染色时间：根据染液质量、新旧、浓度和气温染色时间：根据染液质量、新旧、浓度和气温l染色用水染色用水PH7.0PH7.07.27.2谢谢个人观点供参考，欢迎讨论
