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1、第第32 2讲基因工程讲基因工程考点基因工程考点基因工程1.基因工程基因工程(1)广义概念：把一种生物的广义概念：把一种生物的(细细胞胞核核、染染色色体体脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸等等)移移到到另另外外一一种种生生物物的的细细胞胞中中去去，并并使使这这种种遗遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中传物质所带的遗传信息在受体细胞中。(2)核心：构建核心：构建。(3)基因工程原理：基因重组。基因工程原理：基因重组。(4)理论基础：理论基础：是是生生物物遗遗传传物物质质的的发发现现，DNA双双螺螺旋旋结结构构的确立以及遗传信息传递方式的认定。的确立以及遗传信息传递方式的认定。(5)技术保障：技术保障：、DN
2、A连连接接酶酶和和质质粒粒载体的发现和运用。载体的发现和运用。遗传物质遗传物质表达表达重组重组DNA分子分子DNA限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2.基因工程的工具基因工程的工具(1)限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶来源：主要从来源：主要从中分离纯化出来。中分离纯化出来。作用作用a.特异性识别双链特异性识别双链DNA分子的某种分子的某种。b.切割相应两个核苷酸之间的切割相应两个核苷酸之间的。结果：产生结果：产生或平末端。或平末端。原核生物原核生物特定特定核苷酸序列核苷酸序列磷酸二酯键磷酸二酯键粘性末端粘性末端(2)DNA连接酶连接酶作用：将具有相同作用：将具有相同的的两两个个DNA片片段段连连
3、接接在一起，形成在一起，形成。(3)载体载体常用载体质粒：在细菌中独立于常用载体质粒：在细菌中独立于之之外外，为为DNA分子，能分子，能，常含有特殊的，常含有特殊的作作为为标标记记基基因因，以以供供目目的的基基因筛选。因筛选。其他载体：噬菌体、其他载体：噬菌体、等。等。粘性末端或平末端粘性末端或平末端磷酸二酯键磷酸二酯键拟核拟核双链环状双链环状自主复制和稳定存在自主复制和稳定存在抗生素抗性基因抗生素抗性基因动植物病毒动植物病毒3.基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤基因文库基因文库未知未知PCR技术技术已知已知稳定存在稳定存在遗传遗传农杆菌转化法农杆菌转化法显微注射显微注射感受态感受态
4、抗生素抗生素DNA分子杂交分子杂交个体生物学水平个体生物学水平4.基因工程的应用基因工程的应用(1)用于遗传育种：定向变异，用于遗传育种：定向变异，强强；克克服服远远缘缘杂交杂交的障碍。的障碍。(2)用于疾病治疗：用于疾病治疗：生产基因工程生产基因工程，如胰岛素、乙肝疫苗等。，如胰岛素、乙肝疫苗等。基因治疗：向目标细胞中引入基因治疗：向目标细胞中引入的的基基因因，或或基基因因缺缺陷陷，达达到到治治疗疗的的目目的的。如对如对B型血友病治疗获得成功。型血友病治疗获得成功。(3)用于生态环境保护用于生态环境保护目的性目的性不亲和不亲和药物药物正常功能正常功能纠正纠正补偿补偿1.(201510月月浙浙
5、江江选选考考节节选选)科科研研人人员员拟拟将将已已知知的的花花色色基基因因(目目的的基基因因)转转入入矮矮牵牵牛牛的的核核基基因因组组中中，培培育育新新花花色色的的矮矮牵牵牛牛。请请回回答：答：(1)为为了了获获得得大大量量的的目目的的基基因因，将将其其与与含含有有抗抗生生素素抗抗性性基基因因的的质质粒粒DNA形形成成重重组组DNA，再再与与经经_(A.氯氯化化钙钙B.氯氯化化钠钠C.蔗蔗糖糖D.葡葡萄萄糖糖)处处理理的的大大肠肠杆杆菌菌液液混混合合，使使重重组组DNA进进入入大肠杆菌。大肠杆菌。(2)从从扩扩大大培培养养的的大大肠肠杆杆菌菌中中提提取取含含有有目目的的基基因因的的DNA，用用
6、_分分别别切切割割含含目目的的基基因因的的DNA和和农农杆杆菌菌的的Ti质质粒粒，然然后后用用DNA连接酶连接，形成重组连接酶连接，形成重组DNA并导入农杆菌。并导入农杆菌。(3)提提取取叶叶片片组组织织的的DNA，采采用用PCR技技术术_目目的的基基因因，鉴鉴定目的基因是否成功导入。定目的基因是否成功导入。(4)为为判判断断本本研研究究是是否否达达到到预预期期目目的的，可可比比较较转转基基因因植植株株和和非非转转基因植株的基因植株的_性状。性状。解解析析(1)用用氯氯化化钙钙处处理理大大肠肠杆杆菌菌，使使大大肠肠杆杆菌菌处处于于感感受受态态，使使重重组组DNA能能够够进进入入大大肠肠杆杆菌菌
7、，完完成成重重组组DNA的的导导入入。(2)用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶分分别别切切割割含含目目的的基基因因的的DNA和和农农杆杆菌菌的的Ti质质粒粒，然然后后用用DNA连连接接酶酶连连接接，形形成成重重组组DNA分分子子。(3)采采用用PCR技技术术可可对对特特定定DNA片片段段进进行行扩扩增增。(4)检检测测转转基基因因植植物物中中目目的的基基因因的的表表达达情情况况，可可以以对对转转基基因因植植物物个个体体的的相相应应性性状状变变化化进进行行鉴鉴定定，本研究中可以比较转基因植株和非转基因植株的花色来鉴定。本研究中可以比较转基因植株和非转基因植株的花色来鉴定。答案答案(1)A(2)
8、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(3)扩增扩增(4)花色花色2.(20164月月浙浙江江选选考考节节选选)兔兔肝肝细细胞胞中中的的基基因因E编编码码代代谢谢甲甲醛醛的的酶酶，拟拟利利用用基基因因工工程程技技术术将将基基因因E转转入入矮矮牵牵牛牛中中，以以提提高高矮矮牵牵牛对甲醛的代谢能力，请回答：牛对甲醛的代谢能力，请回答：从从兔兔肝肝细细胞胞中中提提取取mRNA，在在_酶酶的的作作用用下下形形成成互互补补DNA，然然后后以以此此DNA为为模模板板扩扩增增得得到到基基因因E。在在相相关关酶酶的的作作用用下下，将将基基因因E与与Ti质质粒粒连连接接在在一一起起，形形成成_，再再导导入入用用氯化钙
9、处理的氯化钙处理的_，侵染矮牵牛叶片。，侵染矮牵牛叶片。解解析析mRNA在在逆逆转转录录酶酶的的作作用用下下形形成成互互补补DNA。将将基基因因E与与Ti质质粒粒连连接接在在一一起起，形形成成重重组组DNA分分子子。重重组组DNA分分子子可可导导入入用用氯氯化化钙钙处处理理的的农农杆杆菌菌细细胞胞，再再用用处处理理的的农农杆杆菌菌侵侵染染矮矮牵牵牛牛叶叶片，从而使基因片，从而使基因E整合到矮牵牛细胞的染色体整合到矮牵牛细胞的染色体DNA上。上。答案答案逆转录重组逆转录重组DNA分子分子(重组质粒重组质粒)农杆菌农杆菌本题组对应选修三本题组对应选修三P1P12，基因工程，基因工程1.限制性核酸内
10、切酶和限制性核酸内切酶和DNA连接酶为基因的连接酶为基因的和和_提供了必要手段，而提供了必要手段，而能能够够将将外外源源基基因因运运送送到到细细胞胞中中实现基因工程的目的。实现基因工程的目的。2.质粒是能够质粒是能够的的双双链链环环状状DNA分分子子，独独立立于于之外存在，是一种特殊的遗传物质。之外存在，是一种特殊的遗传物质。3.基因工程的基本操作步骤有：目的基因的基因工程的基本操作步骤有：目的基因的、重重组组DNA的的、重组、重组DNA受体细胞、受体细胞、含含有目的基因的受体细胞和有目的基因的受体细胞和的的表表达达五五个个方方面面，其其中中核心是核心是。分离分离重组重组载体载体自主复制自主复
11、制拟核拟核获得获得形成形成导入导入筛选筛选目的基因目的基因构建重组构建重组DNA分子分子4.基因治疗是向基因治疗是向中中引引入入正正常常功功能能的的基基因因，以以纠正或补偿基因的纠正或补偿基因的，达到治疗的目的。，达到治疗的目的。5.利用农杆菌利用农杆菌质质粒粒介介导导，可可以以将将目目的的基基因因导导入入植植物物受受体体细胞中，并整合到细胞中，并整合到中，实现稳定表达。中，实现稳定表达。目标细胞目标细胞缺陷缺陷Ti染色体染色体DNA角度角度1基因工程工具基因工程工具1.已已知知一一双双链链DNA分分子子，用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶切切割割得得到到长长度度为为120 kb(kb：千千
12、碱碱基基对对)片片段段；用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶切切割割得得到到40 kb和和80 kb两两个个片片段段；同同时时用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶和和限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶切切割割时时，得得到到10 kb、80 kb和和30 kb 3个个片片段段。据据此分析该双链此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况为分子结构及酶切位点情况为()解解析析根根据据题题意意，该该DNA用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶切切割割后后得得1条条片片段段，故故为为环环状状DNA，根根据据两两酶酶的的作作用用特特点点，可可知知酶酶切切图图谱谱为为D。答案答案D2.如如图图为为DNA分分子子在
13、在不不同同酶酶的的作作用用下下所所发发生生的的变变化化，图图中中依依次次表表示示限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶、DNA聚聚合合酶酶、DNA连连接接酶酶、解解旋旋酶酶作作用的正确顺序是用的正确顺序是()A. B.C. D.解解析析限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶可可在在特特定定位位点点对对DNA分分子子进进行行切切割割，为为限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶。DNA聚聚合合酶酶在在DNA分分子子复复制制时时将将脱脱氧氧核核苷苷酸酸连连接接成成脱脱氧氧核核苷苷酸酸链链，为为DNA聚聚合合酶酶。DNA连连接接酶酶可可将将限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶切切开开的的磷磷酸酸二二酯酯键键连连接接在在一一
14、起起，为为DNA连连接接酶酶。解解旋旋酶酶的的作作用用是是将将DNA双双链链解解开开螺螺旋旋，为为复复制制或或转转录录提供模板，提供模板，为解旋酶。为解旋酶。答案答案C1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(2)切切割割后后产产生生末末端端的的种种类类粘粘性性末末端端和和平平末末端端：当当限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶在在它它识识别别序序列列的的中中轴轴线线两两侧侧将将DNA的的两两条条链链分分别别切切开开时时，产产生生的的是是粘粘性性末末端端，而而当当限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶在在它它识识别别序序列列的中轴线处切开时，产生的是平末端。的中轴线处切开时，产生的是平末端。2.限制性核酸内切
15、酶与限制性核酸内切酶与DNA连接酶的关系连接酶的关系3.与与DNA有关的酶的比较有关的酶的比较项目项目作用底物作用底物作用部位作用部位形成产物形成产物限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNA分子分子磷酸二酯键磷酸二酯键粘性末端或平末端粘性末端或平末端DNA连接酶连接酶DNA片段片段磷酸二酯键磷酸二酯键重组重组DNA分子分子DNA聚合酶聚合酶脱氧核苷酸脱氧核苷酸磷酸二酯键磷酸二酯键子代子代DNA解旋酶解旋酶DNA分子分子碱基对中的氢键碱基对中的氢键 形成脱氧核苷酸单链形成脱氧核苷酸单链DNA(水解水解)酶酶DNA分子分子磷酸二酯键磷酸二酯键游离的脱氧核苷酸游离的脱氧核苷酸角度角度2基因工程原理和技
16、术、应用基因工程原理和技术、应用1.天天然然的的玫玫瑰瑰没没有有蓝蓝色色花花，这这是是由由于于缺缺少少控控制制蓝蓝色色色色素素合合成成的的基基因因B，而而开开蓝蓝色色花花的的矮矮牵牵牛牛中中存存在在序序列列已已知知的的基基因因B。现现用用基基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是()A.提提取取矮矮牵牵牛牛蓝蓝色色花花的的mRNA，经经逆逆转转录录获获得得互互补补的的DNA，再再扩增基因扩增基因BB.利利用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶从从开开蓝蓝色色花花矮矮牵牵牛牛的的基基因因文文库库中中获获取取基因基因BC.利用利用DNA聚合酶将基因聚合酶将基因B
17、与质粒连接后导入玫瑰细胞与质粒连接后导入玫瑰细胞D.将基因将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞解解析析获获取取目目的的基基因因B，可可先先提提取取矮矮牵牵牛牛蓝蓝色色花花的的mRNA，经经逆逆转转录录获获得得互互补补的的DNA，再再经经PCR扩扩增增，A正正确确；题题干干中中已已指指明明基基因因B序序列列已已知知，故故常常用用化化学学方方法法人人工工合合成成和和PCR技技术术扩扩增增基基因因，而而从从基基因因文文库库中中获获取取序序列列未未知知的的目目的的基基因因，B错错误误；连连接接目目的的基基因因与与质质粒粒的的酶酶是是DNA连连接接酶酶
18、，C错错误误；将将目目的的基基因因导导入植物细胞，常用农杆菌转化法，不使用大肠杆菌，入植物细胞，常用农杆菌转化法，不使用大肠杆菌，D错误。错误。答案答案A2.科科学学家家将将外外源源目目的的基基因因与与大大肠肠杆杆菌菌的的质质粒粒进进行行重重组组，并并在在大大肠肠杆杆菌菌中中成成功功表表达达。下下图图表表示示构构建建重重组组质质粒粒和和筛筛选选含含目目的的基基因因的的大肠杆菌的过程。请据图回答问题：大肠杆菌的过程。请据图回答问题：(1)步骤步骤和和中常用的工具酶是中常用的工具酶是_和和_。(2)图图中中质质粒粒上上有有抗抗氨氨苄苄青青霉霉素素和和抗抗四四环环素素两两个个标标记记基基因因，经经过
19、过和和步步骤骤后后，有有些些质质粒粒上上的的_基基因因内内插插入入了了外外源源目目的的基基因因，形形成成重重组组质质粒粒，由由于于目目的的基基因因的的分分隔隔使使得得该该抗抗性性基基因因失失活。活。(3)步步骤骤是是_的的过过程程，为为了了促促进进该该过过程程，应应该该用用_处理大肠杆菌。处理大肠杆菌。(4)步步骤骤将将三三角角瓶瓶内内的的大大肠肠杆杆菌菌接接种种到到含含四四环环素素的的培培养养基基C上上培培养养，目目的的是是筛筛选选_，能能在在C中中生生长长的的大大肠肠杆杆菌菌有有_种。种。(5)步步骤骤：用用无无菌菌牙牙签签挑挑取取C上上的的单单个个菌菌落落，分分别别接接种种到到D(含含氨
20、氨苄苄青青霉霉素素和和四四环环素素)和和E(含含四四环环素素)两两个个培培养养基基的的相相同同位位置置上上，一一段段时时间间后后，菌菌落落的的生生长长状状况况如如图图所所示示。含含目目的的基基因因的的菌菌落落位位于于_(D、E)上，请在图中相应的位置上圈出来。上，请在图中相应的位置上圈出来。解解析析(1)形形成成重重组组DNA分分子子需需要要用用到到限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶和和DNA连连接接酶酶两两种种工工具具酶酶。(2)由由图图可可知知，有有些些质质粒粒上上的的氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因被被切切开开并并接接入入了了外外源源目目的的基基因因。(3)步步骤骤是是将将重重组组质质
21、粒粒(目目的的基基因因)导导入入大大肠肠杆杆菌菌(受受体体细细胞胞)的的过过程程；应应用用CaCl2溶溶液液处处理理大大肠肠杆杆菌菌增增加加大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞壁壁的的通通透透性性，利利于于重重组组质质粒粒进进入入大大肠肠杆杆菌菌。(4)步步骤骤的的目目的的是是筛筛选选含含四四环环素素抗抗性性基基因因的的大大肠肠杆杆菌菌，能能在在C中中生生长长的的大大肠肠杆杆菌菌有有2种种，一一种种是是只只含含有有四四环环素素抗抗性性基基因因的的大大肠肠杆杆菌菌，另另一一种种是是含含有有四四环环素素抗抗性性基基因因和和目目的的基基因因的的大大肠肠杆杆菌菌。(5)含含有有目目的的基基因因的的大大肠肠杆杆菌菌
22、不不抗抗氨氨苄苄青青霉霉素素，不不能能在在含含有有氨氨苄苄青青霉霉素素的的培培养养基基中中生生长长，因因此此含含有有目目的的基基因因的的菌落存在于菌落存在于E上。上。答答案案(1)限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶DNA连连接接酶酶(2)氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性(3)将将重重组组质质粒粒(目目的的基基因因)导导入入大大肠肠杆杆菌菌(受受体体细细胞胞)CaCl2溶液溶液(4)含四环素抗性基因的大肠杆菌含四环素抗性基因的大肠杆菌2(5)E1.受体细胞与导入方法受体细胞与导入方法生物种类生物种类植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞常用方法常用方法农杆菌转化法农杆菌转化法显微注射技术
23、显微注射技术感受态细胞法感受态细胞法受体细胞受体细胞体细胞体细胞受精卵受精卵细菌细胞细菌细胞转化过程转化过程将将目目的的基基因因插插入入到到Ti质质粒粒的的TDNA上上农农杆杆菌菌导导入入植植物物细细胞胞整整合合到到受受体体细细胞胞的的染色体染色体DNA上上表达表达将将含含有有目目的的基基因因的的表表达达载载体体提提纯纯取取卵卵(受受精精卵卵)显显微微注注射射受受精精卵卵发发育育获获得得具具有有新新性性状状的动物的动物Ca2处处理理细细胞胞感感受受态态细细胞胞重重组组表表达达载载体体与与感感受受态态细细胞胞混混合合感感受受态态细胞吸收细胞吸收DNA分子分子2.基因工程中的几种检测方法基因工程中的几种检测方法
