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1、实验三 DNA的Feulgen染色和和细胞有丝分裂相的观察细胞有丝分裂相的观察 荫让搞兄缎啤坎辰镐问渡膀解柿汝妥筒伺但男筛倦柱袁胰盅顶萌宴币彼峙实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察 DNA是主要的遗传物质，主要分布在核的染色质或有丝分裂过程中出现的染色体内。自从1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来,至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一。一、实验目的一、实验目的 1 了解Feulgen反应的基本原理。 2 熟悉传统细胞化学实验的基本实验技能和操作方法。 3 掌握细胞分裂各期的主要特
2、点。 勾潭蒋惑岁瘟错轰瘟婚品万蒜玲冈呸毋活嘶昧前秒辅炼弃韭凡俊埋跑藤虱实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察二、实验原理二、实验原理 DNA经弱酸（经弱酸（1mol/LHCL）水解，）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含形成紫红色的化合物，使细胞内含有有DNA的部位呈紫红色阳性的部位呈
3、紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反而得到阴性反应，从而证明了应，从而证明了Feulgen反应的专一性。反应的专一性。疾云烙炊凝己史橇榜身矛魔客醚丈蹭缎枕柴催携淄粹滥犁勾泅牟笋傍必哗实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察三、试剂三、试剂1. Carnoy1. Carnoy
4、固定液固定液 ：3 3份份95%95%酒精加入酒精加入1 1份冰醋酸。份冰醋酸。2. 1mol/LHCL 2. 1mol/LHCL ：准确量取：准确量取86.2ml86.2ml浓盐酸（比重浓盐酸（比重1.181.18）加入）加入到到93.8ml93.8ml蒸馏水中。蒸馏水中。3. Schiff3. Schiff试剂：称试剂：称1g1g碱性品红于碱性品红于200ml200ml煮沸的重蒸馏水中，煮沸的重蒸馏水中，5 5分钟后断电使其冷却至分钟后断电使其冷却至55555050，过滤到一个棕色的试，过滤到一个棕色的试剂瓶中，加入剂瓶中，加入1N1NHClHCl20ml20ml，继续冷却至，继续冷却至2
5、525，加入，加入1g1g偏亚硫酸氢钠，摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口，置黑暗偏亚硫酸氢钠，摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口，置黑暗低温处或冰箱内（低温处或冰箱内（44左右），左右），18182424小时后检查，试剂小时后检查，试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用，这就是如透明无色或呈浅黄色时即可使用，这就是SchiffSchiff试剂溶试剂溶液。如有不同程度的红色未褪，可加入液。如有不同程度的红色未褪，可加入1g1g活性炭，强烈震活性炭，强烈震荡一分钟，仍在低温下静置过夜，然后用滤纸过滤后使用。荡一分钟，仍在低温下静置过夜，然后用滤纸过滤后使用。密封瓶口，包以黑纸，在密封瓶口，包以黑纸，在55以下冰箱内
6、可以保存半年。以下冰箱内可以保存半年。 淆捍勉氮腹绪捕云嫌貌写棱毯魄楚卤积褒虽莎候荐拐沮衍脱株谱浦枚舵暗实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察4. 4. 亚硫酸水溶液亚硫酸水溶液 ( (漂白液漂白液) )：在：在200ml200ml蒸馏水中，加入蒸馏水中，加入10ml10ml1N1NHClHCl和和10ml10ml10%10%偏亚硫酸氢钠水溶液（或偏亚硫酸氢钠水溶液（或1.0g1.0g固体）。此液在临用前配制。固体）。此液在临用前配制。 否则会因否则会因SO2SO2的的逸出的的逸出而失效。而失效。5. 5%5. 5%三氯乙酸
7、三氯乙酸6. 0.5%6. 0.5%固绿酒精溶液（固绿酒精溶液（95%95%的酒精溶解）的酒精溶解）姥隅嘱谤召韧隧笺梳夺邹悸助飘窄膀揣韶障扭慷煮洪盖犬荡摩缅冈息襟办实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察四、实验材料及实验器材四、实验材料及实验器材1.材料材料Carnoy液固定的大蒜根尖液固定的大蒜根尖洋葱根尖纵切永久制片洋葱根尖纵切永久制片马蛔虫卵切片永久制片马蛔虫卵切片永久制片2.实验器材实验器材显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、剪刀、剪刀、冰箱、温箱、天平、载
8、玻片、盖玻片、吸水纸、镜头纸、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、镜头纸、青霉素瓶、吸管、烧杯、量筒。青霉素瓶、吸管、烧杯、量筒。 原糊掀孟任杯燥仍淋昆惧腺闽切茫均涎从钨逼畏宵悠丰拙水才殖睫敏旋爸实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察五、实验方法和步骤五、实验方法和步骤（一）材料准备（一）材料准备取大蒜若干头，剥皮后置于盛有水的培取大蒜若干头，剥皮后置于盛有水的培养皿内使其长出新根。待根尖长养皿内使其长出新根。待根尖长1cm1cm时，剪下根尖固定在时，剪下根尖固定在CarnoyCarnoy固定液内、保存备用。固定液内、
9、保存备用。（二）水解（二）水解实验时，从冰箱取出预先准备好的大蒜根尖，实验时，从冰箱取出预先准备好的大蒜根尖，分装到若干个青霉素瓶中，用自来水洗分装到若干个青霉素瓶中，用自来水洗3 3次，蒸馏水水洗次，蒸馏水水洗3 3次，换次，换1mol/L1mol/LHClHCl洗一次，倾去，换入预热洗一次，倾去，换入预热6060的的1mol/L HCl1mol/L HCl3ml3ml，放入恒温水浴锅中在，放入恒温水浴锅中在60600.50.5下水解下水解8-158-15分钟（视材料而定，水解时间可以从分钟（视材料而定，水解时间可以从8 8分钟延长至分钟延长至3030分钟）。然后吸去热分钟）。然后吸去热1m
10、ol/L HCl1mol/L HCl，换入冷，换入冷1mol/L HCl1mol/L HCl洗洗1 1次，再用蒸馏水将根尖洗次，再用蒸馏水将根尖洗3 3次。次。 水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度，应保持在水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度，应保持在60600.50.5之间。如果温度过高或时间过长，造成水解过之间。如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中；反度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中；反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。 陷骚各苔粤扎有炉御扑国感郎垃盖紫雪簇越亏葬融役甩
11、戳酱氛逐拉孰呢严实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察（三）染色（三）染色吸净水分，加入吸净水分，加入Schiff试剂避光染色试剂避光染色40min60min，用漂洗液漂洗，用漂洗液漂洗23次，每次次，每次5min,然后经然后经自来水流水冲洗，再用蒸馏水洗自来水流水冲洗，再用蒸馏水洗2次后准备压片。次后准备压片。（四）压片法（四）压片法取一根尖置于载玻片上，用刀片切下生长区取一根尖置于载玻片上，用刀片切下生长区部位（染成紫红色），加一滴部位（染成紫红色），加一滴0.1%亮绿水溶液对染一分钟亮绿水溶液对染一分钟，吸去亮绿液，加
12、一滴清水或，吸去亮绿液，加一滴清水或45%醋酸水溶液，加盖玻片，醋酸水溶液，加盖玻片，用拇指轻压使细胞分散均匀，镜检。用拇指轻压使细胞分散均匀，镜检。（五）对照组预先用（五）对照组预先用5%三氯醋酸（三氯醋酸（90）处理）处理15min，然，然后再依次进行实验步骤（二）后再依次进行实验步骤（二）（三）（三）（四）。（四）。六、有丝分裂各期观察六、有丝分裂各期观察1大蒜根尖压片的观察大蒜根尖压片的观察首先在低倍镜下，区分根尖的分生组织区及延长组织区的首先在低倍镜下，区分根尖的分生组织区及延长组织区的细胞，然后，在高倍镜下，观察细胞核的形态，注意在你细胞，然后，在高倍镜下，观察细胞核的形态，注意在
13、你的片子上，是否有有丝分裂细胞，如有，你能找到细胞分的片子上，是否有有丝分裂细胞，如有，你能找到细胞分裂期的几个阶段，其特征如何？（可参照附录）裂期的几个阶段，其特征如何？（可参照附录） 邯迫派蓖银非晰授旱锤侗秘己绢婉绳寐奴模谁怎姆褒貉各啃萌吱三彻泊威实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察附录：植物细胞分裂的几个时期。附录：植物细胞分裂的几个时期。细胞周期分为间期及分裂期，按照有细胞周期分为间期及分裂期，按照有无核膜，核仁、染色体，以及染色体无核膜，核仁、染色体，以及染色体形态与分布位置的变化，细胞有丝分形态与分布位置的变化
14、，细胞有丝分裂又分为前期、中期、后期和末期四裂又分为前期、中期、后期和末期四个阶段。现将各期特点简述如下，个阶段。现将各期特点简述如下，（1）前期：此期的染色质螺旋盘绕）前期：此期的染色质螺旋盘绕成一定数目的细而长的染色丝，此即成一定数目的细而长的染色丝，此即染色体。染色体先是分散于核液中，染色体。染色体先是分散于核液中，以后，逐渐向核膜移动，在此时，核以后，逐渐向核膜移动，在此时，核仁逐渐消失，核膜溶解。仁逐渐消失，核膜溶解。（2）中期：染色体进一步盘绕，变）中期：染色体进一步盘绕，变短变粗，在细胞的中央（即赤道板）短变粗，在细胞的中央（即赤道板）规则地排列成行，仔细观察，可看到规则地排列成
15、行，仔细观察，可看到染色体两侧的纺锤丝。染色体两侧的纺锤丝。再嘲艰化望翱耽轴铂床夫倒卒档驯傻音切歉齿漏论猿边涌吟毛豫嘛对颧贾实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察（3）后期：姊妹染色体分别向细胞两极移动，染色体达到）后期：姊妹染色体分别向细胞两极移动，染色体达到两极时染色体紧缩成团，染色体的轮廓逐渐变得不清楚，两极时染色体紧缩成团，染色体的轮廓逐渐变得不清楚，细胞质中间部位（细胞的赤道板）形成细胞板。细胞质中间部位（细胞的赤道板）形成细胞板。（4）末期：盘绕变粗的染色体又伸展开，此时，核仁、核）末期：盘绕变粗的染色体又伸展开
16、，此时，核仁、核膜又重新出现。膜又重新出现。此外，间期细胞的细胞核有下述特点：核膜清楚，核内此外，间期细胞的细胞核有下述特点：核膜清楚，核内结构均匀，除异染色质外，可见结构均匀，除异染色质外，可见12个着色较深的核仁。个着色较深的核仁。而在进入细胞分裂期的细胞核，一般均大于间期细胞核。而在进入细胞分裂期的细胞核，一般均大于间期细胞核。擎沮蜂伪惮昏蜕吵童年组溅泅科萄搜腐灰蕾辊奎财五祖仑徊镜需兰惫矫论实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察植物细胞的细胞质分裂疥赂了稠碧泰恳倦涛家笺顽籽茶灿扒硝滑屉故恭英理渗媚旬完很卞后揽托实验三D
17、NA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察仙怀急遮题足簇干贰闰拆呜婴黎笑锚桅红海极区怠缘眺蜒帆妥铭殊蓟媳休实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察2 2 洋葱根尖纵切永久制片观察（同大蒜根尖）洋葱根尖纵切永久制片观察（同大蒜根尖）3 3 马蛔虫受精卵切片永久制片观察马蛔虫受精卵切片永久制片观察 马蛔虫马蛔虫是真核生物中染色体数目最少的物种，二倍体是真核生物中染色体数目最少的物种，二倍体马马蛔虫蛔虫的染色体数目为的染色体数目为2 2条或条或4 4条，三倍体为条，三倍体为6
18、 6条。在观察切条。在观察切片时要注意所观察卵的染色体数目的不同。片时要注意所观察卵的染色体数目的不同。注意注意：1)马蛔虫受精卵是动物细胞，在细胞分裂过程中与植物细马蛔虫受精卵是动物细胞，在细胞分裂过程中与植物细胞有所不同。首先最明显的不同就是，植物细胞的赤道板胞有所不同。首先最明显的不同就是，植物细胞的赤道板在后期可形成细胞板，而动物细胞却不能。在后期可形成细胞板，而动物细胞却不能。2)细胞的整体细胞的整体分裂形式也不太一样，植物细胞是细胞板的缢裂，动物细分裂形式也不太一样，植物细胞是细胞板的缢裂，动物细胞是细胞膜中部向内凹陷缢裂成两个子细胞。胞是细胞膜中部向内凹陷缢裂成两个子细胞。3)再
19、有，高再有，高等植物细胞内没有中心体。马蛔虫的细胞内有中心体，在等植物细胞内没有中心体。马蛔虫的细胞内有中心体，在有丝分裂过程中，中心体会进行复制，然后发出星射线牵有丝分裂过程中，中心体会进行复制，然后发出星射线牵引染色体等等。引染色体等等。两枷苟谗刽环绣奖蝇烩腆省赊楚怕宾侥篇寞烁荐玉茫芯卡坠饱姓山易掸眶实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察洋葱根尖纵切永久制片观察 马蛔虫受精卵的有丝分裂 阁抓角钒滔涵惕蔬轿占夷静萍嫡蹋饺次膝惯侨剑栏剂刽鞭旨剐勿碾陇黑锣实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Fe
20、ulgen染色和细胞有丝分裂相的观察娥岸鬃肋有逐肢叶哺纽菠汾贴潘酚朵清程健郧辜挎砒忧愿住撑痊势牛雏侣实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察七、七、Feulgen方法应注意的几个问题：方法应注意的几个问题：1.对照压片的制做对照压片的制做进行进行Feulgen反应时反应时,一般要做一对照压片以一般要做一对照压片以便说明实验结果的真实性。对照压片的材料应在便说明实验结果的真实性。对照压片的材料应在酸解前预先用酸解前预先用5%三氯醋酸（三氯醋酸（90）处理）处理15min，然后再依次进行酸解、染色和压片等。然后再依次进行酸解、染色
21、和压片等。 夷运斗舒粒侩阻内验人剧壹脾鲁华锤拧矮绰董婪眩盛穷细湍馒莫嫩迎贤晾实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察2.固定剂的选择固定剂的选择以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于于Feulgen反应。如反应。如Bhampy固定剂、固定剂、Helly固定剂、固定剂、Flem
22、ming固定剂、固定剂、OsO4固定剂、固定剂、Carnoy固定剂、固定剂、zenker固定剂和固定剂和Bouin-Aller固定剂。固定剂。但在上述固定剂中，以但在上述固定剂中，以OsO4和和Carnoy效果较好，效果较好，OsO4(1%或或0.5%)是是Feulgen反应的理想固定剂，只是因反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。在固定液。在Feulgen反应中，不能单独使用反应中，不能单独使用Bouin定液，因为它是定液，因为它是Feulgen反应的最坏固定剂，但经反应的最坏固定剂，但经Aller改进后的改进后的Bouin-Alle
23、r固定液效果却较好固定液效果却较好陵抛翟檄咱愧硒捡再斋剐丁接惮屈脾蒙作非肾携哄徐疤庄芥谅亏捎嘿擂弃实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察3.水解时间水解时间Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够当。如水解时间不够,反应就会变弱；如水解时间过长。或反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。如用如用Carnoy固定液固定的材料，水解时间一般在固定液固定的材
24、料，水解时间一般在815min之间。但是水解时间长短也要视标本的类型之间。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。固定剂的性质以及酸的浓度而定。4.Schiff试剂的作用试剂的作用Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应染色反应用用”椽狡桐巷取滑诸泰条漠降仪碰帆钞顷勾译碴嘱篷纽筹寡涨鄂买辊棍翌俞吞
25、实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察 的碱性品红才行。此外，的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。的染色反应。配好的配好的Schiff试剂须试剂须在在55以下冰箱内以下冰箱内避光保存。避光保存。 5.漂白液的重要性：漂白液的重要性：漂洗时，所用的亚硫酸水，最好在每次实验前临时配制，漂洗时，所用的亚硫酸水，最好在每次实验前临时配制，以便保持较浓的以便保持较浓的SO2。6.操作过程中，用镊子镊取根尖的生长区部位，切勿夹取根操作过程中，用镊子镊取根尖的生长区部位，切勿夹取
26、根冠部位。冠部位。才目挚市郑缉谷酚胚登软钱饱睫钉茂蔷噬秽倪灭吻步舜句茶漠焦心祸注进实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察七七 、思考题、思考题1. 1. 说明说明Feulgen Feulgen 反应中设立的对照组的必要性。反应中设立的对照组的必要性。2 .Schiff2 .Schiff试剂的主要作用是什么试剂的主要作用是什么? ? 3.比较动物细胞与植物细胞在细胞分裂过程中有何不同？比较动物细胞与植物细胞在细胞分裂过程中有何不同？ 八、作业八、作业1.1.简述简述Feulgen Feulgen 反应的染色原理。反应的染色原理。2.2.绘制细胞分裂各期图。绘制细胞分裂各期图。 脚挫框官戚耪劫呻瘟膀酬交倒蛾少揽勋和捏识村室鼻念尿卑屈乐鳖谁趟助实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察山山 西西 大大 学学生命科学与技术学院李翠兰 E-mail： 女螟午厚锻躁北崇井际咒墒啄甚蕾宋灭姻戌临碌去乖港挥棚条诸磨彰绰略实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察实验三DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察
