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1、微生物数量的测定微生物数量的测定v微生物的生长通常以群体的生长作为指标。群体生长表现微生物的生长通常以群体的生长作为指标。群体生长表现为细胞数目的增加或者细胞物质的增加。为细胞数目的增加或者细胞物质的增加。v测定微生物数量的主要方法：测定微生物数量的主要方法：显微镜直接计数法显微镜直接计数法（不辨死活）（不辨死活）平板菌落计数法（形成菌落的微生物）平板菌落计数法（形成菌落的微生物） P32P32光电比浊法光电比浊法（不用于颜色太深的样品）（不用于颜色太深的样品）测定细胞重量法（测定丝状真菌生长量）测定细胞重量法（测定丝状真菌生长量）测定细胞总氮量或总碳量（适于浓度较高的样品）测定细胞总氮量或总
2、碳量（适于浓度较高的样品）。 实验十一、显微镜直接计数法实验十一、显微镜直接计数法目的要求目的要求v了解血球计数板的构造、计数原理和计了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法；数方法；v掌握显微镜下直接计数的技能。掌握显微镜下直接计数的技能。v显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。直接计数法优缺点v优点：直观、快速、操作简单。v缺点：不能区分死菌与活菌，所得为总数；不适于对运动细菌的计数。常用计菌器常用计菌器v常用计数器有血球计数板(血细胞计数板)、Petroff-Hauser计菌器以及Hawksle
3、y计菌器等。v各种计数板的计数原理相同，只是血球计数板较厚，不能使用油镜观察，只能计数较大的霉菌孢子和酵母菌；而后两种计菌器细菌，可以使用油镜观察，因此可以直接计数细菌。 血球计数板血球计数板 PetroffPetroff-Hauser-Hauser计菌器计菌器HawksleyHawksley计菌器计菌器v血球计数板是一块特制的载玻片，血球计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一两半，每一边的平台上各列有一个方格网。个方格网。v血球计数板是一块特制的载玻片，血球计数板是
4、一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一两半，每一边的平台上各列有一个方格网。个方格网。v每个方格网共分为九个大方格，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为中间的大方格即为计数室计数室。v血球计数板是一块特制的载玻片，血球计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一两半，每一边的平台上各列有一个方格网。个方格网。v每个方格网共分为九个大方格，每个方格网
5、共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。中间的大方格即为计数室。v计数室的刻度一般有两种规格：计数室的刻度一般有两种规格：一种是一个大方格分成一种是一个大方格分成2525个中方个中方格，而每个中方格又分成格，而每个中方格又分成1616个小个小方格；另一种是一个大方格分成方格；另一种是一个大方格分成1616个中方格，而每个中方格又分个中方格，而每个中方格又分成成2525个小方格。个小方格。v血球计数板是一块特制的载玻片，血球计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一两半，
6、每一边的平台上各列有一个方格网。个方格网。v每个方格网共分为九个大方格，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。中间的大方格即为计数室。v计数室的刻度一般有两种规格：计数室的刻度一般有两种规格：一种是一个大方格分成一种是一个大方格分成2525个中方个中方格，而每个中方格又分成格，而每个中方格又分成1616个小个小方格；另一种是一个大方格分成方格；另一种是一个大方格分成1616个中方格，而每个中方格又分个中方格，而每个中方格又分成成2525个小方格。个小方格。v无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400400个。每一
7、个大方格边长为个。每一个大方格边长为lmmlmm，则每一个大方格的面积为，则每一个大方格的面积为lmmlmm2 2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm0.lmm，所，所以计数室的容积为以计数室的容积为0.lmm0.lmm3 3( (万分之一毫升万分之一毫升) )。计数方法计数方法v计算：计算：1mL1mL菌液中总菌数菌液中总菌数=A/5*25*10=A/5*25*104 4*B=50000*A*B*B=50000*A*B1mL1mL菌液中总菌数菌液中总菌数=A/5*16*10=A/5*16*104 4*B=32000*A*B*B=320
8、00*A*B其中其中B B为稀释倍数。为稀释倍数。v使用血球计数板计数时，通常使用血球计数板计数时，通常数数5 5个中方格个中方格的总菌的总菌数数A A，然后求每个中方格的平均值，再乘上大方格，然后求每个中方格的平均值，再乘上大方格（计数室）中方格的数量，就得出一个大方格中的（计数室）中方格的数量，就得出一个大方格中的总菌数。数两个大方格总菌数，平均后，再换算成总菌数。数两个大方格总菌数，平均后，再换算成每毫升菌液中微生物细胞的数量。每毫升菌液中微生物细胞的数量。注意事项注意事项v对于对于出芽的酵母菌出芽的酵母菌，芽体，芽体达到母细胞大小一半时，达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。即可
9、作为两个菌体计算。v对于对于压线酵母压线酵母，按照数上，按照数上不数下、数左不数右的原不数下、数左不数右的原则计数则计数实验器材实验器材活材料：活材料： 酿酒酵母（酿酒酵母（SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae）培养液。）培养液。其他器材：其他器材： 显微镜、血球计数板、显微镜、血球计数板、电吹风、盖玻片电吹风、盖玻片（22mm22mm22mm22mm）、吸）、吸水纸、水纸、计数器计数器、滴管、滴管、擦镜纸。擦镜纸。实验方法实验方法1 1、用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液（以、用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液（以
10、每个小方格中每个小方格中5 51010个菌为宜）。个菌为宜）。2 2、取洁净的血球计数板一块（事先镜检），盖上一块盖玻、取洁净的血球计数板一块（事先镜检），盖上一块盖玻片。片。3 3、将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，沿盖玻片边缘摘、将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，沿盖玻片边缘摘入一小滴，让菌悬液利用毛细渗透作用充满计数区。入一小滴，让菌悬液利用毛细渗透作用充满计数区。4 4、加样后静止、加样后静止5min5min，将计数板置显微镜载物台上，先用低，将计数板置显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数区，然后换高倍镜计数。（光不宜太强）倍镜找到计数区，然后换高倍镜计数。（光不宜太强）5 5、计数完毕
11、，将血球计数板在水龙头下流水冲洗干净，用、计数完毕，将血球计数板在水龙头下流水冲洗干净，用电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉淀。电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉淀。作业作业结果（填表）结果（填表） P55P55实验十二、光电比浊计数法实验十二、光电比浊计数法v了解光电比浊计数法的原理。了解光电比浊计数法的原理。v学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。目的要求目的要求基本原理基本原理v当当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。及吸收作用使光线的透过量降低。v在一定范围内，微
12、生物细胞浓度与透光度成反在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以，而光密度或透光度可以由光电池精确测出。因此，可用一系列已知菌由光电池精确测出。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度数的菌悬液测定光密度，作出光密度-菌数标菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。标准曲线中查出对应的菌数。光电比浊计数法优缺点光电比浊计数法优缺点v优点：简便、快速、连续测定、适合自动化。优点：简便、快速、连续测定、适合自动化。v缺点：缺点：光密度受细胞大小、形态、培养液
13、成分以及选用的光密度受细胞大小、形态、培养液成分以及选用的波长的影响；波长的影响；对于不同微生物的菌悬液要选择相应的菌株和培养对于不同微生物的菌悬液要选择相应的菌株和培养条件制作标准曲线；条件制作标准曲线；对于颜色太深的样品或含其它具有吸光值的物质不对于颜色太深的样品或含其它具有吸光值的物质不能用此法。能用此法。器材器材v菌种菌种 酿酒酵母培养液酿酒酵母培养液v仪器或其他用具仪器或其他用具 分光光分光光度计，血细胞计数板，显度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。菌吸管，无菌生理盐水等。操作步骤操作步骤v标准曲线的制作标准曲线的制作v样品测定样
14、品测定每毫升细胞数每毫升细胞数光光密密度度值值标准曲线的制作标准曲线的制作1 1、血球计数板直接计数：首先采用血球计数直接计血球计数板直接计数：首先采用血球计数直接计数酿酒酵母菌悬液。（数酿酒酵母菌悬液。（ 2102108 8菌菌/mL /mL ）2 2、稀释菌液：将上述已知浓度的酿酒酵母菌悬液用、稀释菌液：将上述已知浓度的酿酒酵母菌悬液用无菌生理盐水进行无菌生理盐水进行两倍梯度稀释两倍梯度稀释, ,共稀释共稀释6 6个浓度个浓度: : 1101108 8、 5105107 7、 2.5102.5107 7、 1.25101.25107 7、 6.25106.25106 6、 3.125103
15、.125106 6。3 3、测、测ODOD值：以无菌生理盐水作为对照，于波长值：以无菌生理盐水作为对照，于波长560nm560nm处用处用1cm1cm比色杯测定上述各菌液的比色杯测定上述各菌液的ODOD值。值。4 4、以、以ODOD值为纵坐标，每毫升菌数为横坐标，绘制标值为纵坐标，每毫升菌数为横坐标，绘制标准曲线。准曲线。样品测定样品测定1、稀释样品：将待测菌悬液用无菌生理盐水适当稀释。2、在560nm波长用1cm比色皿测定稀释后菌悬液的光密度。3、计算：根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数，乘以稀释倍数就得到原液中细菌数。721型分光光度计操作方法型分光光度计操作方法v接通电源
16、，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热1010至至1515分钟。分钟。v将灵敏度开关调至将灵敏度开关调至“1”1”档（若零点调节器调不到档（若零点调节器调不到“0”0”时，时，需选用较高档）。根据所需波长转动波长选择钮。需选用较高档）。根据所需波长转动波长选择钮。 v将空白液及测定液分别倒入比色杯将空白液及测定液分别倒入比色杯3/43/4处，用擦镜纸擦清外处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。壁，放入样品室内，使空白管对准光路。 v在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向T=0T=0处。处。v盖上暗箱盖，调节盖上暗箱盖，调节“100”100”调节器，使空白管的调节器，使空白管的T=100T=100，指，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。并记录。 v比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。软纸擦净。
