《转氨酶ATA117在大肠杆菌中的高效重组表达及催化制备西他列汀》由会员分享，可在线阅读，更多相关《转氨酶ATA117在大肠杆菌中的高效重组表达及催化制备西他列汀（54页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、转氨WATA117在大肠杆菌中的高效重组表达及催化制备西他列汀指导教师签名：黑评论文评阅人1：篦另许同评阅人2：彩许间评阅人3：忍许闻评阅人4： 评阅人5： 答辩委员会主席：务椽魏t委员1：侬看赦授委员2：缺吗瘵授委员3：麻竦另徴委员4：林疥 委员5： 答辩日期：Efficient Expression of Transaminase ATA117 in Escherichia coli for the Production of SitagliptinAuthor9s signature:Supervisor* s signature:Thesis reviewer 1: Thesis re
2、viewer 2： Thesis reviewer 3： Thesis reviewer 4： Thesis reviewer 5: Chair:(Committee of oral defence)Committeeman 1: Committeeman 2： Committeeman 3： Committeeman 4： Committeeman 5: Date of oral defence：浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是木人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果.除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发 表或撰写过的研究成果，也不包
3、含为获得浙江大学或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中 作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：壬一骆 签字日期:学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江大学有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江大学可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保管的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名： J必导师签名：丿乩 幷签字日期:2训年3月/o日签字日期：2o叶年3月（0H浙江大学硬吐学位论文摘要
4、致谢岁月如歌，光阴似箭，两年半的研究生生活即将结束。经历了完成课题的纠 结与辛苦，找工作的喧嚣与坎坷，我开始享受写论文时的那份宁静与思考。回首 两年半的求学生涯，面对即将告别的学生时代，我深深的感激那些曾经引导我、 帮助我、激励我的人。首先感谢实验室三位老师，杨立荣，吴坚平和徐刚老师，三位老师严谨的治 学态度、渊博的学识、敬业的精神是我毕生学习的楷模，你们教会我的不仅是毕 生受用的科研和学习的能力，更重要的是教会我做人的道理。你们既是我的恩师, 更是我的亲人，无论在实验还是生活上，都给予了我太多的帮助，在此向您们致 以我最真挚的敬意和感谢！愿恩师们身体健康，工作顺利！感谢实验室的陈辉、费辉、孟
5、枭、罢晓林、李牧、陈少云、马宏敏、郭法谋 等博士师兄，是你们在实验上给了我诸多指导和帮助；感谢同一届的戴晓庭、崔 丽娟、高雪丽、张洼潭，是你们陪伴我度过难忘的研究生生涯；感谢实验室的周 勇，李一冰，蒙丽君，郭丽，许芳馨，徐佳，何秀娟等师弟师妹；感谢所有帮助 和关心我的人。愿你们实验顺利，感情顺利，事业顺利！同组之谊，同室之谊， 我将终身难忘！感谢我的母校一浙江大学,母校给了我一个宽阔的学习平台和丰富的学习资 源，让我可以不断的吸取新知，充实自己。特别感谢我的父母，25年的养育之恩，比天高，比海深，你们是我求学路 上最坚强的后盾，你们对我无私的爱与付出是我最强大的动力，这份恩情我将用 一生去报答
6、！最后，感谢参与我论文评审和答辩的老师，是你们给了我宙视自己学习成果 的机会，你们对我的帮助是一笔无价的财富，祝你们一生幸福安康！王璐二零一四年三月 于求是园摘要转氨晦ATA117在合成手性胺类药物西他列汀中具有重要用途，本论文构建 了不同的表达体系，优化表达条件，以实现ATAT117的高效表达，并对重组转 氨酶的发酵工艺和产品西他列汀的制备工艺进行研究。我们首先以E.coli BL21(DE3)作为宿主，构建了 PBV220-ATA117 , pCDFDuet-ATA117, pETDuet-ATA117 和 pRSFDuet-ATA117 四种重组载体，从 蛋白表达水平和催化活力上进行了考
7、察，选出表达能力校高的载体 pETDuet-ATA117,其活力为 137U/L,比活为 0.24U/mg 粗蛋白。对重组转氨酶的酶学性质进行了表征，其最适pH为9.0,在pH7.0-10.0的 范围内都表现出很高的稳定性，该酶同时也具有很好的热稳定性，在反应温度 45 时，酶活力半衰期达到47.8 h,在常温下，半衰期超过100h。为了提高Eco(pETDuet-ATA117)的发酵酶活，我们先使用单因素法和响应面 法结合的方式对培养基成分进行了优化，得到最佳培养基配方：甘油14.45g/L, 酵母粉7.27g/L,胰蛋白陈5.72g/L, NaCl 10g/L, K2HPO44g/L.在优
8、化培养基 的基础上又对诱导条件进行了研究，最适诱导条件下晦活为713.7 U儿。随后进 行了 10 L发酵罐中的分批和补料发酵工艺研究，最终菌体密度达到29.78 g/L, 酶活力达到3971 U/L,比LB培养基发酵提高了 30多倍。通过制备工艺的优化，50 g/L底物浓度时，最佳的助溶剂为40%的DMSO, 最佳的底物：细胞：辅酶比例为50:12.5:0.37,在此比例下，采用全细胞催化，8 h可将底物完全转化为西他列汀，ee99.95%。随后对产物西他列汀的分离纯化 工艺进行了初步探索，最终收率达到80%。关傩词：转氨酶，重组表达，响应面优化，西他列汀浙江大学硬士学位论文Abstract
9、AbstractAminotransferase ATA117 has an important application in the synthesis of chiral amine drugs- Sitagliptin. We construct different expression systems to make the ATA117 gene expressed better. The best engineered bacteria was selected for the study of fermentation and the preparation of sitagli
10、ptinFristly, four engineered plasmids PBV220-ATA117, pCDFDuet-ATAl 17, pETDuet-ATA117 and pRSFDuet-ATA117 were constructed, the protein expression and catalytic activity were the two examined factors The results suggested that pETDuet-ATA117 is our best choice.The enzymatic properties of recombinant
11、 aminotransferase ATA117 were characterized The optimum pH is 9.0. The ATA117 shows better stability in the range of pH 7.0-10.0. The enzyme also has a good thermal stability. In the reaction temperature of 45 *C, the half-life of the enzyme activity have achieved 47.8 h At room temperature, the hal
12、f-life is more than 100 hIn order to achieve higher fermentation activity of aminotransferase ATA117, the single-factor method and the response surface method were used to optimize the medium components The optimized concentration of each medium component is(g/L): Glycerol 14.45, Yeast extract 7.27,
13、 Tryptone 5.72, NaCl 10, K2HPO4 4. On the basis of the medium optimization, we study the induction conditions of recombinant transaminase ATA117 After that, the batch and the fed-batch fermentation process have been investigated in a 10 L fermentor. We finally get the cell densityfdry weight) of 29.
14、78 g/L and enzymatic activity of 3971 U/L, which were more than 30 times higher than that of LB medium.Under the 40% DMSO concentration, 50:12.5:0.37 substrate, cell coenzyme ratio , it takes 8 hours to transfer almost all of the substrates to Sitagliptin The product sq)aration and purification tech
15、nology also have been explored and a final yield of 80% was achieved.illKeywords: aminotransferase, recombinant expression, response surface optimization, SitagliptinIV浙江大学硕士学位论文目录目录致谢 I摘要 IIAbstractIll甫1l. i生物催化制备手性胺11.1.1外消族胺的动力学拆分(KR) 11.1.2胺的动态动力学拆分(DKR) 31. 13转氨酶不对称合成手性胺41.2转氨酶简介51.2.1转氨酶的分类61.2.2转氨酶的催化机制81.2.3(D转氨酶的应用81.3西他列汀111.3.1西他列汀的化学名称及结构121.3.2西他列汀的药理作用121.3.3西他列汀的合成131.4本课题的研究思路与主要内容15第二章转第障基因的克隆和重组表达172.1引言172.2材料与方法172.2.1菌种与质粒172.2.
