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1、精选优质文档-倾情为你奉上目的意义植物在正常条件下游离脯氨酸(proline,Pro)含量很低,但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累,并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。因此,脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标,测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。一、酸性茚三酮法(一)原理植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应,生成稳定的红色产物。该产物在515nm有一最大吸收高峰,其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。因此,样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。除脯氨酸外,酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形
2、成红色产物,碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰,在同类样品的测定中可忽略不计,在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。(二)实验材料、仪器与试剂1. 实验材料:正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。2. 仪器:分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。3. 试剂:(1)酸性茚三酮试剂:称取重结晶茚三酮放入烧杯,加冰醋酸60mL、6molL-1磷酸40mL 于70下溶解,冷却后装入棕色瓶内贮于4冰箱中,24h内稳定。现用现配。(2)100gmL-1脯氨酸母液:精确称取脯氨酸溶于少量80乙醇中,用蒸馏
3、水定容至100mL。(3)其他试剂:人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80乙醇。(三)操作步骤1. 标准曲线制作:(1)取7个50mL容量瓶,分别放入脯氨酸母液、,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,各瓶的脯氨酸浓度分别为、gmL-1。(2)另取具塞刻度试管8只(07号),0号加入2mL蒸馏水,17号分别加入不同浓度的标准系列各2mL,再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL,充分摇匀,加盖,沸水浴1015min。以0号管溶液为空白对照,于515nm处比色,记录消光值,以消光值为纵坐标,脯氨酸浓度为横坐标,绘制标准曲线。2. 样品提取:称取鲜样,放入研钵或匀浆器中,加入80乙醇3mL和石英砂少许研成匀浆,移入
4、具塞刻度试管中,并用80乙醇冲洗研钵,匀浆液与洗液合并总量为10mL,加盖后沸水浴煮沸10min,再加活性炭粉末,振荡过滤(用80乙醇冲洗滤纸与残渣3次),滤液于8085水浴上蒸去乙醇,残渣用蒸馏水洗涤并定容至100mL供测定之用。3. 样品测定:取大试管1只,加样品提取液10mL和人造沸石1g,摇动10min并滤去人造沸石。取具塞刻度试管2只,各加入上述过滤样液2mL、冰醋酸2mL、茚三酮试剂2mL,摇匀后加盖,于沸水浴中煮沸1015min,冷却后于515nm下比色,记录OD值。(四)结果计算式中:为样品脯氨酸含量(gg-1);为从标准曲线上查得脯氨酸浓度(gmL-1);为样品稀释体积(mL
5、);为样品重量(g)。【附注】脯氨酸与茚三酮于100下的反应时间需严格控制,不宜过久,否则将产生沉淀。二、磺基水杨酸法(一)原理当用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即成红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中。色素颜色的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色测定吸光度,从标准曲线上查出脯氨酸的含量。(二)实验材料、仪器与试剂1. 实验材料:待测植物(水稻小麦、玉米、高粱、大豆等)叶片。2. 仪器:分光光度计、冰浴锅、研钵、小烧杯、容量瓶、具塞刻度试管、普通试管、移液管、注射器、漏斗、滤纸、剪刀等。3. 试剂:(1)酸性茚
6、三酮溶液:将茚三酮溶于30mL冰醋酸和20mL 6molL-1磷酸中,搅拌加热(70)溶解,贮于冰箱中。(2)3磺基水杨酸:称取3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100mL。(3)其他试剂:冰醋酸、甲苯。(三)操作步骤1标准曲线的制作(1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸,倒入小烧杯内,用少量蒸馏水溶解,然后倒入250mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,此标准液浓度为100gmL-1。(2)取6个50mL容量瓶,分别加入脯氨酸原液、,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,各瓶的脯氨酸浓度分别为l、2、3、4、5、6gmL-1。(3)取6支具塞刻度试管,分别吸取2mL系列标准浓度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和
7、2mL酸性茚三酮溶液,每管在沸水浴中加热30min。(4)冷却后各试管准确加入4mL甲苯,振荡30s,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液。(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中,以甲苯溶液为空白对照,于520 nm波长处进行比色。(6)以消光值为纵坐标,脯氨酸浓度为横坐标,绘制标准曲线。2样品的测定(1)准确称取不同处理的待测植物叶片各,分别置于具塞刻度试管中,然后向各管分别加入5mL 3磺基水杨酸溶液,在沸水浴中提取10min(提取过程中要经常摇动),冷却后过滤于干净的试管中,滤液即为脯氨酸的提取液。(2)吸取2mL提取液于另一干净的具塞刻度试管中,加入2mL冰醋酸及2mL酸性茚三酮试剂,在沸水浴中加热30min,溶液即呈红色。(3)冷却后加入4mL甲苯,摇荡30s,静置片刻,取上层液至10mL离心管中,以3000rpm离心5min。(4)用注射器轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中,以甲苯为空白对照,在分光光度计上520nm波长处比色,记录吸光度值。(四)结果计算式中:为样品脯氨酸含量();为测定液中脯氨酸浓度(gmL-1);5为3磺基水杨酸的量(mL);为样品鲜重(g)。专心-专注-专业